黄壤假单胞菌溶磷特性及对pH缓冲的响应

乔志伟

(安顺学院 资源环境与工程学院，贵州 安顺 561000)

磷是作物生长最重要的营养元素之一，土壤磷含量及其有效性对植物生长具有重要作用。黄壤是贵州农业最主要的土壤类型，土壤有效磷的含量较低[1，2]，化学磷肥中的有效态磷易与土壤中的铝、铁、钙等离子结合成难溶态磷，造成磷素在土壤中累积，磷肥利用率降低[3]；贵州属于典型的喀斯特区域，水土流失严重，累积在土壤中的磷素会随着水土流失对水体环境产生影响。因此如何提高该区域土壤有效磷含量和磷肥利用率是磷素研究的重点之一。

溶磷细菌是一类在难溶态磷有效化过程中发挥重要作用的微生物，冯哲叶等[4]研究表明在土壤中接种溶磷细菌可以显著增加土壤有效磷含量，Anzury等[5]、Pradhan等[6]研究都证明溶磷细菌可以增加土壤有效磷和提高土壤磷素有效性。溶磷细菌主要通过分泌低分子量有机酸溶解难溶态磷[7，8]。目前，关于黄壤区溶磷细菌的研究资料及可利用的菌株资源较少，且溶磷细菌对土壤酸碱缓冲响应如何等问题有待解决。本试验对黄壤区筛选出的1株假单胞菌溶磷特性进行了研究，并通过调节培养液pH模拟土壤酸碱缓冲特性对其生长和溶磷能力的影响，以期为该区域溶磷细菌的研究提供高效的菌株资源，并为其利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 菌株来源

试验用溶磷细菌是通过PVK平板分离法，从贵州省安顺市西秀区的农田土壤(质地为黄壤)中筛选出的，并在实验室内通过形态观察、生理生化特征和16sRNA 序列分析，鉴定其属于假单胞菌属，编号为P1。

1.1.2 培养基

溶磷能力测定培养基(NBRIP培养基)：葡萄糖 10.0 g， 硫酸铵0.1 g，氯化钾 0.2 g，硫酸镁 0.25 g，磷酸三钙5.0 g，氯化镁 5.0 g，蒸馏水1.0 L，调节pH到7.0；活化培养基: 蛋白胨10.0 g, 牛肉膏5.0 g，氯化钠 5.0 g，蒸馏水1.0 L，调节pH至7.0。

1.2 试验方法

1.2.1 P1对难溶态磷(磷酸三钙、磷酸铝、磷酸铁及磷矿粉)溶解能力的测定

在活化培养基中接种P1菌株，于28 ℃振荡培养24 h，将菌液按照1%(菌液体积与培养液体积比)的量接种在灭菌的NBRIP培养基中，在恒温振荡箱(30 ℃、150 r·min-1)培养7 d，取发酵液测定其有效磷的含量，重复3次，同时设置不接菌的对照处理，测定P1对磷酸三钙的溶解能力(接菌后培养液有效磷的含量与对照处理的差值即为溶磷能力)。

在NBRIP培养基中，将磷酸三钙等质量替换为磷酸铝、磷酸铁、磷矿粉等，培养基其它成分和培养条件不变，测定P1对各难溶态磷的溶磷能力。

1.2.2 培养基中不同种类的碳源及氮源对P1溶磷能力的影响

在NBRIP培养基中，将葡萄糖分别等质量替换为蔗糖、乳糖、淀粉和甘露醇，培养基的其余成分不变，接种活化后的P1菌液培养并测定菌株溶磷能力，确定最佳的碳源；确定最佳碳源后，分别以硝酸钾、硝酸钠、氯化铵、硝酸铵为氮源替换硫酸铵(氮原子摩尔质量相同)，接菌培养测定菌株的溶磷能力，以确定最佳氮源。

1.2.3 培养液初始pH对P1溶磷能力的影响

在NBRIP培养基中，通过0.01 mol·L-1的HCl和0.01 mol·L-1的NaOH来调节培养液的初始pH，将培养液初始pH分别调节为4、5、6、7、8、9，将活化后的P1菌液接种在不同初始pH且灭菌的培养液中，培养7 d后测定发酵液有效磷含量。

1.2.4 培养液pH缓冲对P1溶磷能力的影响

将菌液按照1%(菌液体积与培养液体积比)的量接种在灭菌的NBRIP培养基中，在恒温振荡箱(30 ℃、150 r·min-1)振荡培养。在第1、2、3、4、5、6、7天测定培养液pH、有效磷和菌液密度(OD600)，当培养液pH降至7.0以下，用灭菌后的0.1 mol·L-1NaOH调节至7.0(+NaOH)。同时设置不调节pH的对照处理(-NaOH)，每个处理重复3次。

1.2.5 P1培养液有效磷含量、pH值及菌液密度(OD600)的测定

培养液有效磷测定：将P1发酵液在4 ℃，6 000 r·min-1的条件下离心8 min，取上清液通过钼锑抗比色法测定；pH直接用pH计测定；菌液密度(OD600)测定：取培养好菌株发酵液10 mL于25 mL的离心管中，调节离心机转速为1 500 r·min-1，将菌液离心5 min并吸取上清液3 mL，再加入3 mL 1 mol·L-1的HCl，在600 nm处比色测定，以未接菌的对照作为参比。

1.3 数据处理

本文数据采用方差分析进行数据处理，分析软件为Excel2003和SASV8.1。

2 结果与分析

2.1 假单胞菌P1对不同难溶态磷酸盐的溶解能力

假单胞菌P1在不同难溶态培养液中有效磷含量及溶磷能力见表1。P1在以磷酸三钙为唯一磷源条件下培养液中有效磷含量最高，为558.08 mg·L-1，比对照处理显著增加了16.84倍；在以磷酸铝和磷酸铁为难溶态磷源的培养液中有效磷含量分别为132.45、231.46 mg·L-1，比对照处理显著增加了2.73倍和3.62倍；在磷矿粉为磷源的培养液中有效磷含量最低，仅为26.49 mg·L-1。菌株溶磷能力是培养液中有效磷含量与相应对照处理的差值，P1对磷酸三钙、磷酸铝、磷酸铁、磷矿粉的溶磷能力分别为526.80、96.98、181.38、22.03 mg·L-1。

2.2 培养基不同种类的碳源及氮源对P1溶磷能力的影响

培养基不同种类的碳源及氮源对P1培养液有效磷影响见表2。培养基不同种类的碳源P1培养液有效磷含量不同，以葡萄糖作碳源P1培养液中有效磷含量是最高的558.08 mg·L-1，显著高于其它碳源；以蔗糖和乳糖等双糖作为碳源P1培养液有效磷含量都在400 mg·L-1以上；以淀粉等多糖作为碳源P1培养液有效磷含量最低，仅为173.78 mg·L-1；不同碳源培养液有效磷的含量表明菌株对碳源的利用效率，P1对单糖的利用效率最高，双糖次之，对多糖的利用率最低。P1对甘露醇也有一定的利用能力，在以甘露醇为碳源条件下培养液有效磷含量为291.6 9 mg·L-1。试验最佳碳源为葡萄糖。

以葡萄糖为碳源，培养基不同种类的氮源对P1培养液有效磷含量的影响不同，不同氮源条件下P1培养液有效磷含量在385.07～558.08 mg·L-1，P1菌株在以硫酸铵和氯化铵作为氮源培养液中有效磷含量分别为558.08和544.31 mg·L-1，在以硝酸钾和硝酸钠为氮源条件下P1培养液有效磷含量分别为400.64和385.07 mg·L-1，P1以氨态氮为氮源培养液有效磷含量显著高于以硝态氮为氮源；以硝酸铵为氮源培养液有效磷含量为469.78 mg·L-1。P1在以葡萄糖为碳源、硫酸铵为氮源的条件下培养液有效磷含量最高，为558.08 mg·L-1。

表1 假单胞菌P1在不同种类难溶态磷培养液中有效磷含量及溶磷能力Table 1 Available phosphorus content and phosphorus solubilizing ability of P1 in different kinds of insoluble phosphorus

表2 不同碳源和氮源P1培养液有效磷含量Table 2 Available phosphorus contents in P1 medium with different carbon and nitrogen sources 单位：(mg·L-1)

2.3 培养液初始不同pH值对P1溶磷能力的影响

培养液初始pH的不同对P1培养液有效磷含量影响见表3。培养液初始pH不同P1培养液有效磷含量不同。培养液初始pH从4到7，随着pH 的增加，P1培养液有效磷含量从358.44 mg·L-1显著增加到558.08 mg·L-1；当培养液pH超过7时，随着pH的增加，培养液有效磷减少，培养液初始pH从7到增加到9，培养液有效磷含量从558.08 mg·L-1降低到508.39 mg·L-1。

2.4 培养液pH缓冲对P1生长及溶磷能力的影响

通过0.1 mol·L-1的NaOH来调节P1培养液中的pH(+NaOH)，同时设置不调节pH 的对照(-NaOH)，-NaOH与+NaOH条件下不同培养时间P1培养液有效磷含量、菌液密度OD600、培养液pH的变化分别如图1 A、1B、1C所示。

表3 培养液初始不同pH值下P1培养液有效磷含量

由图1A可知，未调节pH处理P1培养液中有效磷含量从第1天到第6天呈增加的趋势，含量从199.80 mg·L-1显著增加到575.44 mg·L-1，在第7天培养液有效磷含量比第6天减少17.36 mg·L-1，为558.08 mg·L-1，减少量不显著；通过0.1 mol·L-1NaOH调节pH处理P1培养液有效磷含量在第1天到第4天呈增加的趋势，含量从199.80 mg·L-1显著增加到446.44 mg·L-1，从第4天到第7天，培养液中有效磷含量从446.44 mg·L-1显著减少到171.06 mg·L-1。与不调节培养液pH处理相比，从第2天开始，调节pH处理培养液有效磷的含量显著降低，在第2天、3天、4天、5天、6天、7天，调节pH处理培养液有效磷含量分别比对照处理减少71.24、74.23、70.34、133.20、319.07、387.02 mg·L-1。培养液pH缓冲对P1溶磷能力影响显著。

由图1B可知，在第2天、4天、5天和6天调节pH处理P1培养液菌液密度(OD600)与未调节培养液pH处理相比差异不显著，在第3天、7天两者之间OD600值分别相差0.024和0.018， pH缓冲对P1生长的影响较小。

由图1C可知，未调节pH处理P1培养液中pH从第1天到第6天呈减小的趋势，pH值从5.90显著减少到3.57，在第7天培养液pH值比第6天增加了0.52，为4.09；通过0.1 mol·L-1NaOH调节pH处理P1培养液pH在第1天到第3天呈减少的趋势，pH值从5.90显著减少到4.35，从第3天到第7天，pH呈增加的趋势，pH值从4.35增加到6.38。未调节pH处理培养液pH在第1～6天逐渐减少，而调节pH处理培养液pH值仅在第1～3天减小，从第4天开始pH值增加，调节pH处理对培养液pH的影响显著。

-NaOH表示未调节培养液pH处理，+NaOH表示调节培养液pH处理，不同小写字母表示在P为0.05水平下的显著性差异(P<0.05)-NaOH indicated that the pH of culture medium was not regulated, +NaOH indicated the pH of culture medium was regulated, and different lowercase letters showed significant differences (P< 0.05)图1 -NaOH与+NaOH条件下不同培养时间P1培养液有效磷含量(A)、菌液密度OD600(B)、培养液pH(C)的变化Fig.1 Changes of available phosphorus contents (A), density of bacterial solution OD600(B) and medium pH(C) of P1 at different culture times under -NaOH and +NaOH conditions

3 讨论与结论

溶磷细菌溶磷能力的大小是评价其应用潜能的指标之一，将溶磷细菌接种在含有难溶态磷酸盐的培养液中，通过测定培养液有效磷含量反映在实验室培养条件下菌株溶磷能力的大小，进而筛选高效溶磷菌株。目前国内外学者一般以磷酸三钙作为难溶态磷源，Guzel等[9]试验用溶磷细菌在磷酸三钙培养液中有效磷含量为490.00 mg·L-1；蔡璐等[10]在百脉根根际筛选出一株高效溶磷细菌LC15，培养7 d后在磷酸三钙培养液中的可溶性磷为400.49 mg·L-1；乔策策等[11]从玉米根际筛选出多株溶磷细菌，在以磷酸三钙为唯一磷源的培养条件下溶磷量最高为487.67 mg·L-1；梅新兰等[12]从石灰性土壤中分离出的溶磷细菌，其培养液有效磷含量在13.25～559.57 mg·L-1；张淑红[13]筛选的101株溶磷细菌中培养液有效磷含量最高可达653.60 mg·L-1；本试验中假单胞菌P1在磷酸三钙培养液中的有效磷含量为558.08 mg·L-1，且该菌株在磷酸铝、磷酸铁和磷矿粉培养液中溶磷量分别比对照处理显著增加了2.73、3.62、4.94倍，P1不仅对磷酸三钙具有较高的溶解能力，且对其他难溶态磷都有一定的溶解作用，是一株具有应用潜力的高效溶磷菌株。

溶磷细菌对培养基中不同碳源和氮源的利用不尽相同[14]，合适的碳源和氮源可以为其生长提供所需要的物质来源和能量来源，对溶磷能力产生影响。李海云等[15]在红三叶草根际筛选的溶磷细菌以葡萄糖为碳源溶磷能力显著高于其它碳源；黄达明等[16]从土壤作物根际筛选的伯克氏溶磷菌以葡萄糖为碳源、草酸铵为氮源溶磷能力最强；陈炫等[17]研究了从甘蔗根际筛选出的2株溶磷细菌，一株对乳糖和氯化铵的利用率最高，一株以葡萄糖和硝酸钾为碳氮源溶磷能力最强；本试验中P1以葡萄糖为碳源，硫酸铵为氮源培养液有效磷含量最高，为558.08 mg·L-1。P1以氨态氮为氮源培养液有效磷含量显著高于以硝态氮为氮源，Scervino等[18]研究发现溶磷细菌在不同种类的氮源下产生有机酸的种类和含量不同，最终表现在溶磷能力上的差异。

研究溶磷细菌的最终目的在于应用，由于土壤自身对酸碱的缓冲特性，将溶磷细菌施入土壤中，土壤pH基本不发生变化，因此有必要研究溶磷细菌对pH 缓冲的响应。本试验通过调节P1培养液pH来模拟土壤对酸碱的缓冲特性。接种溶磷细菌培养液pH会下降[19]，本试验通过0.1 mol·L-1NaOH调节培养液pH，P1培养液有效磷含量显著低于未调节pH处理，pH缓冲对菌株溶磷能力有较大影响，这与虞伟斌等[20]、李娜等[21]研究结果一致。在第2天、3天调节pH处理培养液有效磷含量与未调节pH处理的差值分别为71.24、74.23 mg·L-1，远低于第5、6天的差值，在第7天的差值达到最大，为387.02 mg·L-1，说明P1菌株在前3天对pH缓冲有较强的响应能力，调节pH处理培养液pH的变化也说明了这一观点，调节pH处理P1培养液pH从第1天到第3天呈减少的趋势，而第4天到第7天呈增加的趋势。菌株在生长前期具有较强缓冲能力是因为培养液营养物质丰富，菌株生长旺盛，产酸能力强，因此缓冲能力较强，在第7天，基本丧失了缓冲能力，因此为微生物生长提供充足的生长基质，可以增强菌株对酸碱缓冲的响应。