实验动物在评价天王补心丹防治失眠中的作用

赵 倩李劲草王 萧*张有志*

(1.广州中医药大学动物实验中心,广州 511400；2.军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所,抗毒药物与毒理学国家重点实验室,北京 100089)

失眠症是指在睡眠时间充足、环境适宜的情况下发生入睡或睡眠维持困难,并导致日间功能障碍的神经精神疾病,以入睡困难、频繁觉醒、早醒和非恢复性睡眠为主要症状[1]。 作为最常见的睡眠障碍,失眠在我国发病率约为40%,其中6%～10%的人被确诊为长期失眠[2]。 临床常用苯二氮卓类和非苯二氮卓类等化学药物进行治疗,作用范围有限且依赖性,无法从根本上治愈睡眠问题,而天王补心丹具有治疗广泛、不易产生成瘾性和耐药性,在失眠防治上具有潜在独特优势。

中医对失眠的认识和治疗历史悠久,中医称失眠为“不寐”、“不得卧”、“目不瞑”,认为由心神失养或心神不安所致。 天王补心丹源起于宋代《校注妇人良方》,方可“宁心保神,益血固精……祛烦热,除惊悸”,有补心安神,滋阴养血的功效,是治疗阴亏血少,虚烦少寐的经典名方[3]。 大量临床及实验研究证实,天王补心丹和方中生地,酸枣仁、五味子、茯苓等可显著提高睡眠质量,但发病机制尚不清楚,基于患者的临床实验有一定的局限性,因此建立理想动物模型十分必要。 理想动物模型应具备3 个原则,即表观效度、结构效度、预测效度,即疾病动物模型应与人类疾病具有相似的症状表现和病理生理机制,并且对经典治疗药物产生相似的反应性。 目前研究常用的失眠模型较为单一。 本文对近10 余年失眠动物模型在天王补心丹中的应用文献进行了汇总,从实验动物种类、造模方法、评价指标等方面总结天王补心丹在失眠动物模型的研究进展,为此方在治疗失眠的基础研究与临床应用中提供新的思路和方法。

1 文献分析

通过3 大数据库,以“失眠”“模型”和“天王补心丹”为主题,时间设定为2010 年1 月～2021 年12月进行检索,其中CNKI 数据库检索到期刊文献25篇,万方数据库5 篇,维普数据库0 篇,选择研究失眠的全部动物实验文献、硕博论文、排除综述类文献及3 大数据库中重复的文献,最终有12 篇文献符合检索要求。 同理,将“天王补心丹”替换为“地黄”“酸枣仁”“五味子”“茯苓”后依次有 3 篇、13 篇、7篇、3 篇文献符合检索要求。 笔者对其组方及方中单药对实验动物种类、动物模型、造模方法、评价指标及模型使用频次进行整理如表1 和表2。

表1 天王补心丹常用实验动物种类、动物模型、造模方法及评价指标Table 1 Animal models, modeling methods and evaluation indexes of common experimental animals of TWBXD

表2 天王补心丹中单味药-地黄、酸枣仁、五味子、茯苓的常用实验动物种类、动物模型、药物剂量及模型使用频次Table 2 Common experimental animal species, animal model, drug dose and model use frequency of single drug in Tianwang Buxin Dan-rehmannia glutinosa, jujube seed, schisandra fruit and tuckahoe

2 PCPA 模型

对氯苯丙氨酸(PCPA) 作为 5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)合成抑制剂,在失眠模型中应用广泛。 戊巴比妥钠阈上或阈下剂量协同实验是评价药物镇静催眠的常用方法。 给予实验动物PCPA 后一般可出现持续48 h 的失眠,表现为白日活动量增加,摄食减少,昼夜节律消失,此模型优点是可以模拟完全睡眠剥夺表型,准确定位改变脑内神经递质,但还可以产生其他病理症状及代谢失衡[12],且因PCPA 药性难溶制备困难,药效难以保证,对操作者技术要求较高,现今文献报到多使用阿拉伯树胶与蓖麻油作为促溶剂,采用腹腔注射的方法最利于吸收,常使用200～220 g SD 大鼠和18～22 g 多种品系成年小鼠制备此失眠模型[13]。

2.1 PCPA 模型在天王补心丹方剂研究中的应用

谢光璟等[4]利用该模型研究天王补心丹加减方对氧化应激通路的作用。 向大鼠腹腔内注射150 mg/kg 的PCPA 溶液7 d,利用戊巴比妥钠协同催眠实验对模型评估,当大鼠发生睡眠时翻正反射消失,觉醒时大鼠在1 min 之内连续完成3 次自主翻转视为翻正反射恢复,15 min 内模型组大鼠较正常对照组大鼠的睡眠潜伏期延长、睡眠持续时间缩短、睡眠发生率降低,证明造模成功。 给予天王补心丹后发现,模型组大鼠的SOD 与GSH-Px 活性增加、MDA 表达下降、硫氧环蛋白2 含量增加而硫氧环蛋白还原酶2 含量减少,其昼夜节律紊乱现象明显改善。 每天8:00 使用400 mg/kg PCPA 混悬液注射2 d,也可使大鼠出现昼夜节律紊乱表现。 刘珊等[11]利用此模型研究天王补心丹调控炎症因子的作用,发现其可以调节大鼠的TLR4、MyD88 表达,使外周血核因子 NF-κB、TRIF、TNF-α、IL-1 水平下降,证实天王补心丹的镇静安神作用机制可能与调节炎症因子,改善机体免疫力有关。

2.2 PCPA 模型在单味药研究中的应用

天王补心丹组方复杂,其广泛的治疗效用与多靶点的药理作用是建立在单药的基础之上的。 药理学研究表明地黄的中枢神经抑制作用研究最早见于1989 年[14],利用PCPA 与戊巴比妥钠协同催眠实验证实地黄和酸枣仁可作用于脑内5-HT、去甲肾上腺素(norepinephrine,NE)、多巴胺(dopamine,DA)等神经递质发挥中枢神经抑制作用。 向小鼠腹腔注射35 mg/kg 戊巴比妥钠溶液,利用翻正反射验证是否造模成功,从开始注射到翻正反射消失时间为入睡潜伏期,翻正反射消失到恢复时间为睡眠时间。 以翻正反射消失达1 min 为入睡标志,30 s 内连续翻转3 次为睡眠结束标志。 记录30 min 内入睡只数、入睡潜伏期及睡眠时间,计算睡眠发生率。王婷婷等[15]给予模型组小鼠腹腔注射40 mg/100 g PCPA,连续2 d,实验结果显示地黄与酸枣仁的潜伏期和睡眠持续时间相似,而睡眠发生率地黄组明显高于酸枣仁组,提示在临床应用中,酸枣仁、地黄对睡后易醒的失眠患者疗效最佳,而不适用于入睡困难的失眠患者。 刘彦飞[16]利用该模型评价证明了地黄各部位均有不同程度的镇静催眠作用。 武锦春等[17]使用该模型发现酸枣仁中的主要物质斯皮诺素、阿魏酸等物质可以作用于NE 能系统和5-HT能系统发挥镇静作用。

研究证实五味子木质素可以下调脑中5-HT、γ氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid,GABA)与谷氨酸(glutamate,Glu)比例以及其受体水平发挥镇静作用。 利用戊巴比妥钠协同催眠实验,在小鼠腹腔注射PCPA 混悬液24 h 后给予五味子素灌胃,30 min后进行戊巴比妥协同催眠实验,以1min小鼠翻正反射消失率为模型成功标准[18-19]。 贾颖等[20]基于此模型的基础上利用超临界CO2萃取方法制备酸枣仁挥发油,发现含有油酰胺等内源性睡眠诱导物可以增加动物模型的慢波睡眠,且酸枣仁油的镇静催眠作用优于皂苷。 徐飞飞等[21]发现枣仁-茯苓-党参水提物也可以调节GABA/Glu 比例。 徐煜彬等[22]进一步研究,证实其主要成分茯苓粗多糖能显著缩短50 mg/kg 及80 mg/kg 戊巴比妥钠诱导的小鼠睡眠潜伏期,延长小鼠睡眠持续时间。 王天合等[23]使用茯苓水提物连续灌胃7 d 后,给予戊巴比妥钠,发现其麻醉时间与小鼠睡眠持续时间增加,以猪苓酸C 等10 种成分与镇静催眠药效密切相

关。 方中其它中药柏子仁、人参、远志也采用此模型所以并未一一阐述[24-27]。 综上所述,利用PCPA失眠模型证实天王补心丹中的生地、酸枣仁、五味子、茯苓等单味药可能通过对神经递质的调控而发挥镇静安神作用。

3 多平台水环境模型

多平台水环境模型是实现非快速眼动睡眠剥夺(REM)的常用模型。 现今研究实验动物多为大、小鼠,大鼠常采用直径6.5 cm 柱台[28],而小鼠以4.5 cm～5.0 cm 居多[29],其原理是根据大、小鼠畏水的天性,无法在充满水的环境中进入完全睡眠状态,实验动物可以在各柱台间自由活动、饮水、摄食,当其进入深睡眠时由于肌张力降低而落入水中,迅速惊醒进而剥夺其REM 睡眠,此模型相对保留慢波睡眠,但小鼠死亡率高,常因落入水中后体力不支浸泡在水中失温溺水而亡。 常用18～22 g 的C57BL/6 雄性小鼠或180～220 g SD 雄性大鼠。

黄晓宇等[5]使用该模型探究天王补心丹加减方与能量代谢、糖代谢及脂质代谢的关系。 将大鼠放置在箱中的柱台上,水面在柱台下1 cm 处,箱子上方放置充足的水和饲料,连续睡眠剥夺7 d,每天20 h,以脑电植入子图谱显示的总睡眠时间和慢波睡眠时间减少作为模型成功的标准,结果显示天王补心丹可使此模型大鼠的MAPK 信号转导通路中的调节因子(如双特异性磷酸酶1)表达水平恢复正常,激活p38 MAPK 信号通路,改善睡眠质量。 将上述造模时间延长至28 d,将脑电芯片植入皮层下,根据脑电特征分析大鼠的睡眠时相,模型组大鼠较正常对照组的总睡眠时间和慢波睡眠时间皆减少时,则造模成功。 该模型证明天王补心丹通过调节单核细胞趋化因子-1(MCP-1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和促炎因子白细胞介素-1β(IL-1β)等炎症因子水平,增加慢波睡眠时长进而改善学习记忆力[6]。将剥夺时间延长至56 d,每天剥夺18 h,并于造模28 d 后开始给药,发现天王补心丹加减方可以降低模型组小鼠下丘脑中食欲素表达,降低血糖值及甘油三酯(TG)、总胆固醇(TCH)和游离脂肪酸(FFA)的含量,证明此方在调控睡眠的同时可以影响糖代谢与脂质代谢[5]。 单药使用该模型较少,赵翠等[30]利用水平台连续造模4 d,发现酸枣仁提取物可以调节T 淋巴细胞亚群平衡,使CD4+T 淋巴细胞比例升高,CD8+T 淋巴细胞比例降低,抑制 TNF-α、IL-6、IL-2、IL-1β 炎症因子表达,增强免疫功能,即“正气存内,邪不可干”,“气充则神旺”。

4 中医阴虚证的复合模型

中医理论认为不寐的病因病机复杂多端,如思虑劳倦则耗伤心脾；心胆气虚则心神不安；心肾不交则水火不济；阴虚火旺则肝阳上扰等。 在不寐众多证型中,以阴虚火旺型不寐最为常见,约占20.2%[31]。 模拟临床阴虚火旺的证型对失眠的研究具有重大意义。 大小鼠作为最常见的模型制备哺乳类动物,与人类具有睡眠相似状态,适应于中医阴虚证型的研究。 多使用Wistar 或SD 成年雄性大鼠制备此类模型[32]。

实验动物研究中常用环磷酰胺或咖啡因建立中医阴虚证型,研究显示注射环磷酰胺后,实验动物的大部分体征符合中医阴虚体质的临床表现,包括精神不振,毛粗黄、掉毛、摄食量减少、消瘦、易被激怒等,生理指标则显示其红细胞(RBC)、血红细胞(HGB)、血小板(PLT)数量均减少[33]。 咖啡因作为腺苷受体拮抗剂,与抑制性神经递质腺苷A2A 受体结合进而抑制睡眠增强觉醒。 在多平台水环境模型的基础上联合咖啡因注射组成慢性复合型睡眠剥夺,可以更好地模拟阴虚不寐患者的临床表型。 该模型常用于探究天王补心丹对下丘脑视交叉上核(SCN)中各种参与昼夜节律调节的肽能神经元的表达,如血管活性肠肽(VIP)、精氨酸加压素(AVP)[8]。 提示天王补心丹可以用来治疗轮班工作睡眠障碍及对咖啡因依赖的患者,但目前对于天王补心丹节律调控的研究较少,需要更深入的探讨。 咖啡因、环磷酰胺与多平台水环境的复合模型考察天王补心丹影响大鼠海马区记忆与学习的功能,采用腹腔注射60 mg/kg 的咖啡因及100 mg/kg环磷酰胺,连续7 d 后进行多平台水环境睡眠剥夺,共剥夺14 d,每天18 h。 结果表明天王补心丹可以调节脑源性神经营养因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)表达[9]。

根据中医阴阳学说理论,老年人多血虚阴亏,由D-半乳糖制备的衰老模型体征符合上述中医阴血亏虚的辨证要点。 黄攀攀等[10]将大鼠颈背部皮下注射D-半乳糖60 mg/kg 持续28 d,于第21 天开始叠加腹腔注射30 mg/kg 咖啡因至第28 天,第29天时利用多平台水环境法连续睡眠剥夺7 d,每天12 h。 根据大鼠体重减轻、力竭性游泳时间减少等指标反应大鼠乏力,同时大鼠心率加快、血压升高、耳温升高证明阴虚发热的中医症状表现,口唇爪甲耳颜色浅淡以及血象特征表明其同时出现血虚的表现。 张舜波等[34]给予模型组大鼠相同剂量的D-半乳糖16 周、环磷酰胺5 d 后再注射50 mg/kg 氢化可的松5 d,置于箱内连续剥夺48 h,证实酸枣仁总皂苷可以调节老年失眠大鼠皮层及海马部位的Glu、GABA 神经递质及受体含量,对临床老年失眠患者意义重大。

5 光照节律紊乱模型

光照模型是通过扰乱实验动物的光周期,达到睡眠剥夺的目的,常应用于睡眠节律紊乱研究。 常见的模型动物有斑马鱼、黑腹果蝇等[35]。 果蝇的光照模型日趋成熟,当果蝇在第1 天晚上被睡眠剥夺时,第2 天白天则会出现睡眠代偿,与年幼果蝇相比,日龄越大的果蝇拥有更多的片段化睡眠和较少的睡眠持续时间,这与人类睡眠极为相似,且与人类基因高度同源[36],被广泛使用。 杨波等[37]使用果蝇光照模型证明酸枣仁皂苷A 与B 的作用机制不同,皂苷B 可以显著减少白天睡眠时间。 选用5～7 日龄野生型Canton S 果蝇,早7 点至晚7 点为正常光照,晚8 点开始,每小时光照10 min 至第2 天早7 点,光照强度设置为650 lx,通过间断性光照使果蝇睡眠片段化达到睡眠剥夺的目的。 当果蝇静止状态超于5 min 时发生睡眠。 以睡眠时间、次数和深度指数等作为果蝇睡眠评价指标。

6 总结

天王补心丹对失眠的防治有较好的作用,作为中医临床经典方剂一直沿用至今。 比较分析失眠模型特征发现,环磷酰胺联合多平台水环境睡眠剥夺等复合模型可以更加准确的模拟中医阴虚的证候体征,也常用于其他中医方剂治疗失眠的模型制备[38]。 注射环磷酰胺后导致免疫缺陷,即中医理论的正气不足,气虚日久累及到阴血,可以复刻阴虚证型。 中医阴阳体质学说认为“阴虚则热”“耗伤津血”,则出现消瘦、烦热等症状与模型动物的摄食减少,毛发枯槁,抓取时反抗强烈相对应,血液亏虚则表现为贫血,反映在血小板、红细胞等生理指标的数量减少。

天王补心丹中单味药生地、酸枣仁、五味子、茯苓等常使用PCPA 与戊巴比妥钠协同催眠实验探究其对中枢神经抑制作用,适用于神经递质的研究。药理学研究已证实以上中药使模型动物的旷场、水迷宫等行为学发生改变,认知和学习能力得到提高[21-22,30]。 中医理论认为“阴为血,阳为气”,生地、酸枣仁、五味子均为滋阴之药,通过滋生阴液而补充血液,而“血养神”“血主濡之”,《灵枢·营卫生会》曰“血者,神气也”。 血有濡养和化神的作用,是神志活动的物质基础,血液充盈,则精力充沛,思维敏捷,认知与学习能力正常。 若血液亏虚,则神志不安,出现不寐、健忘、惊悸、梦遗等症状[39]。 现代研究也证实,睡眠与记忆都是大脑的基本功能,失眠则会影响GABA、NE 等与记忆认知密切相关的神经递质[40]。

多平台水环境模型作为失眠的经典模型,脑电分析证实其结构效度较为理想,实验动物表现出的大部分表型与中医阴虚证相符,但还存在心理应激等影响因素。 光照模型在此方剂的研究中应用较少,但果蝇的分子遗传学优势明显、饲养成本低、寿命短,且模型的表观效度与人类睡眠高度相似性,适用于睡眠节律的研究。

失眠的发病机制十分复杂,研究已证实其发病机制与炎症因子、氧化应激及神经递质密切相关[41],天王补心丹及单药可以作用于以上通路发挥镇静安神作用。 失眠动物模型根据其自身特点被应用于不同研究,但实验动物的生理、病理、解剖结构始终与人存在着差异。 并非人类所有致病因素均能在动物模型中复制,如喜怒忧思悲恐惊七情而导致的情志内伤难以在动物模型中有所体现。 应采用多种因素复合的造模方法,充分模拟失眠复杂的临床发病机制,同时重点关注模型动物一般行为和生理指标与中医证候之间的联系,建立符合中医辨证理论的失眠动物模型,实现对中药复方失眠治疗作用的针对性评价。