白香丹胶囊对大鼠卵巢摘除所致的经前期焦虑症的改善作用

郝 志胡明会邢 影刘 坤张 浩杨焕新李自发耿希文*魏 盛*

(1.山东中医药大学中医学院,济南 250355；2.山东中医药大学实验中心,济南 250355；3.齐鲁工业大学(山东省科学院)生物工程学院,济南 250355)

经前烦躁障碍(premenstrual dysphoric disorder,PMDD)是经前期综合征的一种以情绪症状为主的严重亚型[1]。 患者在月经来潮的前1 周出现情绪不稳定、易怒、抑郁情绪、焦虑、兴趣缺失等症状,并在不久后症状自行改善。 PMDD 已被美国《精神障碍诊断和统计手册》(DSM-V)归为一个新型诊断类别[2]。 值得注意的是,PMDD 与抑郁症和焦虑症的终生共病率很高,超过50%的PMDD 患者被诊断为终生重度抑郁症[3],因此有关PMDD 的诊断与治疗逐渐吸引了社会各界的关注。 目前PMDD 发病的潜在机制仍未明确。

在传统中医学中,PMDD 被冠以月经前后诸症,属于典型情志病证。 现代医家基于肝主疏泄理论,将PMDD 认定为肝气逆证、肝气郁证两种亚型[4]。20 世纪90 年代山东地区女性流行病学调查发现,该病证候呈规律性分布, 肝气逆证占患者总数的58.9%[5],急躁易怒为其最主要的临床表现[6]。 现代研究表明,PMDD 的发病机制可能与黄体期5-羟色胺系统、γ-氨基丁酸A 型受体(GABAA)对神经甾体四氢孕酮的敏感性变化和涉及情绪功能的脑回路改变有关[7],而5-HT3R 和CB1R 共表达于可调控情绪的额叶皮层、海马、杏仁核等脑区GABA 能神经元的突触前膜[8]。 同时,5-HT 与5-HT3R 结合可促进GABA 的释放,CB1R 信号途径可通过逆向传递抑制GABA 的释放。 由前期工作我们发现中药白香丹胶囊(BXD)可能是通过调节血清及大脑皮层中GABA 含量发挥疗效[9],其是否可作用于情绪调节脑区的5-HT3R 和 CB1R 受体进而发挥效应,仍有待进一步探查。 因此,本研究通过观察BXD、5-HT3R 与 CB1R 的特异性激动拮抗剂对PMDD 焦虑症大鼠焦虑样行为的影响,评价比较其干预效应,并对BXD 的干预作用与5-HT3R、CB1R的相关性进行探索。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF 级健康雌性大鼠,Wistar 大鼠 150 只,6 ～ 8周龄,体重(140±20)g；SD 雌性大鼠 50 只,4 ～6 周龄,体重(100±20)g。 由北京维通利华实验动物技术有限公司提供[SCXK(京)2021-0006]。 动物饲养于山东中医药大学实验动物中心[SYXK(鲁)2017-0022],实验操作均在暗淡红灯(＜25 lux)下进行,均遵守美国NIH 颁布的《实验动物护理和使用指南》[10]要求。 本研究获山东中医药大学实验动物伦理委员会批准(DWSY201703013),符合3R 原则。

1.2 主要试剂与仪器

白香丹胶囊(由山东中医药大学药剂实验室提供)；戊巴比妥钠(SigmaAldrich(上海)贸易有限公司,批号20160414)；苯甲酸雌二醇(Macklin 有限公司,批号10042617)；孕酮(SigmaAldrich(上海)贸易有限公司,批号101327062)；雌二醇(Macklin 有限公司,批号10006920)；羧甲基纤维素钠(上海国药集团,批号 20170110)；1-phenylbiguanide(PBG,TCI(上海)化成工业发展有限公司,批号FIA01-SOS)；WIN55212-2(WIN,MCE 中国(上海皓元生物医药科技有限公司),批号 18285)；Granisetron(MCE 中国(上海皓元生物医药科技有限公司),批号 HYB0071)；Rimonabant(MCE 中国(上海皓元生物医药科技有限公司),批号HY-14136)。 SuperMaze 动物行为分析系统(上海欣软信息科技有限公司,型号XR-Xmaze)；旷场实验系统(上海欣软信息科技有限公司,型号XR-XG201)；高架十字迷宫实验系统(上海欣软信息科技有限公司,型号XR-XG201)。

1.3 实验方法

1.3.1 实验设计流程

实验设计流程见图1。

图1 特异性激动/拮抗剂和BXD 对PMDD 焦虑症大鼠模型干预效应流程图Figure 1 Flow chart of intervention effects of specific agonists/antagonists and BXD on PMDD anxiety rat model

1.3.2 构建PMDD 动物模型的复合因子

通过大鼠卵巢摘除、激素诱导和居住入侵3 种复合因子,构建PMDD 焦虑症动物模型。

1.3.3 卵巢摘除手术

手术器械用75%乙醇溶液浸泡并高温消毒,大鼠术前禁食。 于大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠进行麻醉(剂量60 mg/kg),在其后肢髂前上脊上部切口,沿脂肪找到子宫结扎摘除,滴入青霉素钾进行消毒。 术后大鼠单笼饲养,每天腹腔注射青霉素2万单位/只进行消炎,持续3 d。

1.3.4 外源性激素诱导正常动情周期

卵巢摘除术后2 周进行外源激素诱导正常动情周期。 第1 天11:30 每只大鼠皮下注射0.5 μg/0.1 mL 苯甲酸雌二醇,第 2 天 19:30 注射 0.5 μg/0.1 mL 雌二醇,第 3 天 7:30 注射 0.5 mg/0.1 mL 孕酮,持续5 个周期。

1.3.5 居住入侵(resident-intruder test, RIT)构建PMDD 焦虑症大鼠模型

居住入侵实验评估动物由焦虑情绪产生的攻击行为。 实验于12:30～15:30 在暗淡光线(＜2 lux)下进行,摄像记录10 min 内大鼠的攻击行为[11]。混和攻击行为得分的计算公式为:复合攻击行为得分=攻击次数+0.2×攻击时间(s)+撕咬次数+0.2×攀爬时间(s)。

1.3.6 旷场行为测试(open-field test, OFT)

旷场实验检测动物在新异环境中的自主运动行为和焦虑程度[12]。 记录6 min 内大鼠的运动总路程(total distance)、中央区停留时间(time in center area)和中央区进入次数(number of central district entry)。

1.3.7 高架十字迷宫行为测试(elevated plus maze,EPM)

高架十字迷宫评估动物焦虑样行为[13]。 记录5 min 内大鼠进入开放臂次数(open arm entry,OE)、进入开放臂时间(time in open arm, OT)、进入闭合臂次数(close arm entry, CE)、进入闭合臂时间(time in close arm, CT)。 公式:OE% =OE/(OE+CE)×1005,OT%=OT/(OT+CT)×100%。

1.3.8 分组、给药

实验1:统计术后第1 个R 期(receptive phases period)、NR 期(non-receptive phases period)居住鼠RIT 的攻击得分差值,由低到高排序,将差值前30%的大鼠分为对照组,后30%为应激组并将其随机均分为模型组、PBG 组、WIN 组、PBG+WIN 组、BXD组[14]。 灌胃给药12 d,每天8:30 给药,每只大鼠给药量为1 mL/100 g[15]。 实验所需药物均使用0.5%CMC-Na 助溶,给予空白及模型组等体积的CMC-Na溶液。

实验2:大鼠分组包括对照组、模型组、GRA 组、RIM 组、GRA+RIM 组、BXD 组。 其余方法同实验 1。

1.4 统计学方法

采用Graph Pad Prism 8.0 软件进行统计分析,以平均数±标准差()表示。 给药前后组间比较用重复测量的双因素方差分析,超过两组间比较用单因素方差分析,两组间比较用t检验,显著性水平设定为P＜0.05。

2 结果

白香丹胶囊改善经前期焦虑症的作用机制,结果如下。

2.1 特异性激动/拮抗剂和BXD 对PMDD 焦虑症大鼠模型攻击行为的影响

如图2A、2C 所示,实验1、2 基线期应激组的攻击行为得分相较于对照组具有显著差异(P＜0.0001)；如图2B、2D 所示,给药前各应激组的攻击行为得分无显著差异,给药后PBG 组、RIM 组、BXD组的攻击行为得分相较于模型组显著降低(P＜0.001,P＜0.0001)。

图2 特异性激动/拮抗剂、BXD 影响大鼠的攻击行为得分(n=9)Note. A, Scores of aggressive behavior in the control group and the model group in the baseline period of experiment 1. B, Score of aggressive behavior in each group before and after administration in experiment 1. C, In experiment 2, the scores of aggressive behavior in the control group and the model group at baseline. D, Aggressive behavior scores of each group before and after administration in Experiment 2. Compared with the control group,****P＜0.0001. Compared with the model group,＃＃＃P＜0.001,＃＃＃＃P＜0.0001.Figure 2 Aggressive behavior scores of rats affected by specific agonists/antagonists and BXD

2.2 特异性激动剂和BXD 对PMDD 焦虑症大鼠模型旷场测试的影响

2.2.1 给药前后NR 期OFT 结果

如图 3A、3B、3C 所示,实验 1 给药前各组的OFT 总路程无显著差异,各应激组的中央区进入次数及停留时间相较于对照组显著降低(P＜0.05)；如图3D、3E、3F 所示,给药后各组的 OFT 总路程无显著差异,模型组的中央区进入次数及停留时间相较于对照组显著降低(P＜0.05),PBG、BXD 组相较于模型组显著升高(P＜0.05,P＜0.001)。

图3 实验1 给药前后PMDD 焦虑症大鼠模型NR 期OFT 测试结果(n=9)Note. A, Total distance of OFT before administration. B, Number of central area entry before administration. C, Time in center area before administration. D, Total distance of OFT after administration. E, Number of central area entry after administration. F, Time in center area after administration. Compared with the control group,*P＜0.05. Compared with the model group,＃P＜0.05.Figure 3 Test results of OFT in NR phase of PMDD anxiety rat model before and after administration of Experiment 1

2.2.2 给药前后NR 期EPM 结果

如图4A、4B 所示,实验1 给药前各应激组的EPM 开放臂进入次数及时间百分比相较于对照组显著降低(P＜0.05)；如图 4C、4D 所示,给药后模型组的EPM 开放臂进入次数及时间百分比相较于对照组显著降低(P＜0.05)；PBG、BXD 组相较于模型组显著升高(P＜0.05,P＜0.01)。

图4 实验1 给药前后PMDD 焦虑症大鼠模型NR 期EPM 测试结果(n=9)Note. A, Percentage of EPM open arm entry times before administration. B, Percentage of EPM open arm entry time before administration. C,Percentage of EPM open arm entry times after administration. D, Percentage of EPM open arm entry time after administration. Compared with the control group,*P＜0.05. Compared with the model group,＃P＜0.05,＃＃P＜0.01.Figure 4 EPM test results in NR phase of PMDD anxiety rat model before and after administration of Experiment 1

2.3 特异性拮抗剂和BXD 对PMDD 焦虑症大鼠模型旷场测试的影响

2.3.1 给药前后NR 期OFT 结果

如图 5A、5B、5C 所示,实验 2 给药前各组的OFT 总路程无显著差异,各应激组的中央区进入次数及停留时间相较于对照组显著降低(P＜0.05)；如图5D、5E、5F 所示,给药后各组的 OFT 总路程无显著差异,模型组的中央区进入次数及停留时间相较于对照组显著降低(P＜0.01,P＜0.05),RIM 组、BXD 组相较于模型组显著升高(P＜0.05),GRA 组的中央区进入次数显著降低(P＜0.05)。

图5 实验2 给药前后PMDD 焦虑症大鼠模型NR 期OFT 测试结果(n=9)Note. A, Total distance of oft before administration. B, Number of central area entry before administration. C, Time in center area before administration. D, Total distance of OFT after administration. E, Number of central area entry after administration. F, Time in center area after administration. Compared with the control group,*P＜0.05,**P＜0.01. Compared with the model group,＃P＜0.05,＃＃P＜0.01.Figure 5 Test results of OFT in NR phase of PMDD anxiety rat model before and after administration of Experiment 2

2.3.2 给药后NR 期EPM 结果

如图6A、6B 所示,实验2 给药前各应激组的EPM 开放臂进入次数及时间百分比相较于对照组显著降低(P＜0.05)；如图 6C、6D 所示,给药后模型组的EPM 开放臂进入次数及时间百分比相较于对照组显著降低(P＜0.05,P＜0.01),RIM 组、BXD 组相较于模型组显著升高(P＜0.05,P＜0.01),GRA 组的开放臂进入次数相较于模型组显著降低(P＜0.05)。

图6 实验2 给药后PMDD 焦虑症大鼠模型NR 期EPM 测试结果(n=9)Note. A, Percentage of EPM open arm entry times before administration. B, Percentage of EPM open arm entry time before administration. C,Percentage of EPM open arm entry times after administration. D, Percentage of EPM open arm entry time after administration. Compared with the control group,*P＜0.05,**P＜0.01. Compared with the model group,＃P＜0.05,＃＃P＜0.01.Figure 6 EPM test results in NR phase of PMDD anxiety rat model after administration in Experiment 2

3 讨论

本研究利用居住入侵构建PMDD 焦虑症大鼠模型,通过OFT 和EPM 行为学测评,比较了中药白香丹胶囊对比5-HT3R 和CB1R 的拮抗剂和激动剂在改善该模型大鼠动情周期非接受期焦虑样情绪的作用效果。 结果表明:中药白香丹胶囊、5-HT3R激动剂 1-phenylbiguanide 和 CB1R 特异性拮抗剂Rimonabant 可有效纠正PMDD 焦虑症模型大鼠的焦虑样行为。 提示白香丹胶囊可能通过作用于5-HT3R 和CB1R 来发挥抗PMDD 焦虑样情绪作用。

白香丹胶囊是根据我国第1 个针对PMS 肝气逆证的中药复方经前平颗粒化裁而来,由白芍、香附、丹皮的主要药效组分芍药苷、香附挥发油(以香附酮为主要成分)和丹皮酚等配伍组成,具有平肝理气、抗焦虑、缓解愤怒情绪的作用[16]。 然而“肝气逆证模型”的病因、症候表现在动物体内很难模拟,本文通过大鼠卵巢摘除、激素诱导动情周期和居住入侵3 种复合因子制备PMDD 焦虑症动物模型,且白香丹胶囊对其有显著改善作用,故该模型可模拟PMDD 肝气逆证。 本研究结果与尹征[17]、王帅等[18]有关白香丹药效的研究结果一致,即白香丹胶囊可有效改善PMDD 焦虑症动物模型大鼠的焦虑样行为。 然而,由于白香丹胶囊成分的多样性,在该药物作用于PMDD 焦虑症的微观机制方面尚未得到明确。

通过系列行为学测评,我们发现,白香丹胶囊与5-HT3R 激动剂 1-phenylbiguanide 和 CB1R 特异性拮抗剂Rimonabant 发挥了类似的抗焦虑效果。有研究表明,5-羟色胺(5-HT)受体参与调控多种情绪、应激反应[19],其异常信号转导可引起神经内分泌紊乱,是 PMDD 发病的原因之一[20-21]。 5-HT3R属于配体门控离子通道,5-HT 与5-HT3R 结合可促进GABA 的释放,调节郁怒情绪的表达,其异常表达可影响多种神经递质的代谢,进而影响人体的精神健康水平[22-23]。 而GABA 是广泛存在于哺乳动物神经系统中的抑制性神经递质,对于调控神经元的兴奋程度具有重要影响。 GABA 及其受体水平调节紊乱与多种情志病发病机制密切相关[24-25]。 同时,黄体期5-HT 系统异常活动及类固醇孕酮代谢物四氢孕酮引起脑内 GABAA受体的改变,影响GABA 释放进而导致PMDD 的发生[26]。

CB1R 是大麻素受体的主要亚型之一,以神经元的形式广泛分布于前脑、基底核、小脑、海马和大脑皮层等脑区,与情绪反应、应激反应及稳定内环境等方面密切相关[27-28]。 CB1R 可调节突触传递和神经元的兴奋性,突触后神经元可释放内源性大麻样物质与 CB1R 结合,抑制 GABA 释放[29-30]。 内源性大麻素和5-HT 可协同作用调节中枢神经系统,具有调节疼痛、成瘾性、抑郁、焦虑情绪等功能[31]。目前研究已经发现5-HT3R 与CB1R 介导情绪调控脑区GABA 释放参与PMDD 焦虑症发病,5-HT3R和CB1R 共表达于额叶皮层、海马、杏仁核等情绪相关脑区GABA 能神经元的突触前膜,两者协同调控上述脑区GABA 释放。 课题组前期研究结果亦表明,白香丹胶囊可以通过调节血清及大脑皮层中GABA 含量来发挥疗效。 由此,我们有理由推测,白香丹胶囊可能通过作用于5-HT3R 与CB1R,促进相关脑区GABA 的释放,发挥抗PMDD 焦虑症的大鼠焦虑样行为。 然而,本研究仅进行了行为药效表型观察和比较,并未从细胞、分子等微观层面对PMDD的发病及治疗进行深入机理探讨。 今后的工作中我们将选取与这一机制密切相关的信号转导通路深入探查PMDD 发病及中药干预的可能分子机制。