病证结合模式下肺癌实验动物模型的研究进展

谭骏岚易 健王飞英万佳婧覃 丽戴爱国*

(1.湖南中医药大学医学院-血管生物学与转化医学湖南省高校重点实验室,长沙 410208；2.湖南中医药大学干细胞中药调控与应用实验室,长沙 410208；3.湖南中医药大学第一附属医院呼吸科,长沙 410021)

肺癌(lung cancer)主要包括小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)和非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC),是临床常见的呼吸系统恶性肿瘤。 据最新的全球癌症流行病学调查显示[1]:全球肺癌的总体发病率排所有癌症中的第2 位,约占11.4%,而我国肺癌的发病率和死亡率仍位居所有肿瘤中的第1 位。 化疗、靶向治疗、手术治疗、放疗以及新兴的免疫治疗是当前现代医学对肺癌的主要治疗手段[2],但治疗的有效性、复发率及药物所产生的耐药问题和不良反应,尤其是相当一部分患者无法承担高昂的治疗费用,使肺癌的治疗仍面对较大挑战。 中医药作为肺癌综合治疗中的重要组成部分,在提高肺癌晚期患者的生存期[3]及生活质量[4]、减轻放化疗毒副反应[5-6]、缓解临床症状[7]、调节免疫[8-9]方面发挥了重要作用。

动物模型是医学实验研究的重要载体。 由于当前现代医学中的肺癌动物模型并不能较好的贴合中医临床辨证论治的核心特点,使得当前中医药治疗肺癌的机制研究零散及滞后,且缺乏全面系统的深入研究[10]。 近年来,随着既符合西医疾病特征又具备中医证候特点的肺癌病证结合动物模型的构建成功,并逐渐应用于中医药治疗肺癌的机制研究,为充分揭示中医药治疗肺癌的疗效及深入了解其作用的相关机制奠定了基础。

1 肺癌动物模型

临床上,肺癌的发病机制较为复杂,因其高发病率与高死亡率,所以肺癌一直是肿瘤领域的研究热点。 经过长期的研究探索,肺癌动物模型的构建技术已趋于成熟和稳定。 目前肺癌动物模型的种类较多,常用的动物也具有多样性,常用的有裸鼠、A/J 小鼠、C57BL/6 小鼠、SD 大鼠、Wistar 大鼠、BABL/c 小鼠、转基因鼠等。 目前肺癌动物模型中应用最多的为小鼠,因为其基因与人类的同源性高达90%以上,常被用于制备移植性肺癌模型。 其中肺癌鼠类模型如:化学诱导小鼠肺癌模型(苯并芘诱导[11-12]、香烟烟雾诱导[13-14]、N-甲基-N-硝基亚脲(MNU)诱导[15-16]、氨基甲酸乙酯诱导法[17-18]、反式-2,4-癸二烯醛(tt-DDE)诱导[19]、4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶)-1-丁酮(NNK)诱导[20])、化学诱导大鼠肺癌模型(3-甲基胆蒽(MCA)+二乙基亚硝胺(DEN)诱导[21]、二甲基苯并蒽(DMBA)诱导[22]等)、肺癌异位移植模型[23-26]、肺癌原位移植模型[27-29]、基因修饰肺癌模型[30-31]、肺癌转移模型[32-34](见表1)。 不同肺癌动物模型的造模时间具有较大区别,化学诱导的肺癌模型和基因修饰肺癌动物模型的成瘤周期较长,而肺癌移植模型成瘤周期较短。 不同的肺癌动物模型因研究的内容不同而具有各自不同的特点,如化学诱导的大、小鼠肺癌模型常适用于肿瘤预防药物的相关研究。 转基因及移植性肺癌模型常用于肺癌病因学的研究。肺癌转移模型可用于新药研发。 总的来说,理想的肺癌模型需具备以下特点:(1)模型的构建方法简单,可操作性强,造模周期适中,能较好的模拟肺癌病理过程。 (2)模型具有较强的可重复性和稳定性,能较好的反映人体的机能状态,且模型构建费用适合。 目前对于肺癌动物模型的评价方法主要通过动物的症状、生物荧光显像、肿瘤组织病理学及影像学的检查来进行评价[35]。

表1 肺癌常见动物模型的构建方法Table 1 Common animal model construction method for lung cancer

2 病证结合肺癌动物模型

中医古籍中虽没有出现“肺癌”这一病名,但在众多古书籍中所记载的“肺痈”、“肺积”、“息贲”与现代医学中肺癌的临床特点相符。 正气不足是肺癌的主要发病机制和病因,正如《内经》云“正气存内,邪不可干”、“邪之所凑,其气必虚”。 当机体肺气亏虚,邪毒可乘虚入肺,进而邪滞胸中,肺气郁闭,宣降功能失调,气机不畅,血行瘀滞,津液输布失调,聚而为痰,痰凝气滞,阻塞络脉,久则痰瘀胶结于肺而形成肺积。 肺癌的发生发展是多个脏腑共同作用所致,病位虽在肺,与脾、肾密切相关。肺、脾、肾3 脏相互联系、相互影响,共同参与肺癌的病理生理全过程。 总的来说,肺癌属“本”虚“标”实,虚实夹杂性疾病,“本”虚为气阴两虚,“标”实为痰浊、瘀血、气滞。 肺癌虚证以气阴两虚证、阴虚证为多见,实证以血瘀、气滞、痰凝为主。 中医药治疗肺癌疗效确切,临床上根据肺癌的病因病机特点常以“扶正祛邪”为主要治法,“扶正”以补肺益气养阴、健脾益肾为主,“祛邪”以活血化瘀、清热解毒、化痰散结为要[36],姜怡等[37]研究表明通过益气养阴以扶正固表,清热解毒标本兼顾的方法并基于此理论指导下的益气养阴解毒方可以抑制小鼠肺癌原位移植瘤模型的肿瘤生长,并延长小鼠的生存期,其他的经典名方如具有清燥润肺、益气养阴功效的清燥救肺汤的临床疗效同样显著[38],并能通过干扰肺癌细胞的能量代谢来抑制Lewis 肺癌荷瘤小鼠肿瘤的增殖[39]。 陈晓波等[40]根据“肾为先天之本、脾为后天之本”的理论创立的脾肾颗粒,具有培补脾肾、益气生血功效,可通过增强NK 细胞的活性、提高CD4+T 细胞数目和CD4+/CD8+比值来抑制Lewis 肺癌小鼠肿瘤的增殖。

动物模型已成为医学研究的重要手段。 近年来,不断有研究者在基于中医基础理论上建立了具有中医特色的病证结合肺癌动物模型。 目前肺癌病证结合动物模型有4 种:气阴两虚证、脾气虚证、肾虚证、气滞血瘀证(见表2)。

表2 肺癌常用病证结合模型总结Table 2 Summary of the syndrome combination model commonly used in lung cancer

2.1 气阴两虚证

气阴两虚证是肺癌患者临床最为常见的证型[41],通过肺癌病证结合动物模型对该证型的模拟具有广泛的应用价值。 吴海良等[42]采用温热中药给予小鼠灌胃加“刨花烟熏”与Lewis 肺癌荷瘤模型结合起来构建了肺癌气阴两虚病证结合模型,并通过观察小鼠的症状体征, 检测白细胞介素 1(interleukin-1,IL-1)、丙二醛(malonaldehyde,MDA)水平及对肿瘤组织进行病理学检测等方法对模型进行评价。 与对照组相比,病证结合模型组小鼠出现毛发逐渐脱落,无光泽,运动量下降,饮食减少,疲倦乏力,体重下降,气短等气阴两虚症状,且IL-1、MDA 水平升高,病理学观察瘤组织均呈现中低分化的腺癌特征,肿瘤细胞呈浸润生长,坏死较少。 同时进行以方测证,采用具有益气养阴作用的金复康口服液进行干预,发现益气养阴中药组的小鼠肿瘤相比较对照组明显缩小,进一步验证了气阴两虚肺癌模型的构建成功。 除此之外,后续逐渐也有学者在此模型基础上,进行了益气养阴中药治疗肺癌的作用机制研究[43-48]。 因此初步判断,该造模方法具有一定的稳定性和可靠性。

2.2 脾气虚证

脾为肺之母,“脾气散精,上归于肺”,所以肺癌病位虽在肺,但与脾密切相关,脾气虚证在肺癌患者中也是十分常见[41,49]。 钱钧等[50]采用“苦寒泻下法+饥饿法+疲劳法”建立小鼠脾气虚证模型,可在造模3、4 d 后陆续观察到小鼠的脾虚症状,并在造模后第15 天通过血清检测发现脾气虚模型组小鼠血清D-木糖和胃泌素水平明显低于对照组。 随后将小鼠Lewis 肺癌肿瘤细胞株接种于小鼠右腋皮下构建脾气虚肺癌模型。 该课题组的其他成员也同样采取此方法构建脾气虚证肺癌模型,并以此为基础来对益气健脾中药如黄芪建中汤[51]、加味黄芪建中汤[52]、加味四君子汤[53]进行抗肺癌的作用机制研究。

2.3 肾虚证

肺癌乃“本虚标实”之疾病,而正气亏虚之根本在于肾虚[54],因此肾虚所形成的机体内环境也可能是导致肺癌发生发展的重要病因。 豆萌萌等[55]采用手术去势和Lewis 肺癌荷瘤模型结合构建肺癌肾虚病证结合模型,并动态观察小鼠的行为表现、肿瘤生长情况,检测雌二醇、睾酮和肿瘤组织病理等。结果发现肾虚肺癌模型小鼠出现怕光、胆小易惊,毛发干枯且光泽度降低,体重下降,活动时间减少等肾虚证候。 与假手术组相比,肾虚肺癌模型组小鼠的肿瘤增长速度明显增快、肿瘤体积明显增大,血清雌二醇、睾酮明显下降,肺内转移率升高和肺转移结节数量增多,结果表明此模型是可行的,并且干扰因素较少,使模型的可操作性和可控性较强。

2.4 气滞血瘀证

吸烟、环境污染等可导致肺失宣降,气机失常,血行瘀滞,瘀毒气血胶结导致肺癌的发生[56],所以气滞血瘀证也是肺癌患者主要证型之一。 彭召云等[57]采用“肾上腺素+束缚法”与Lewis 肺癌荷瘤模型结合构建了肺癌气滞血瘀病证结合模型,动态观察小鼠的行为表现、并通过检测小鼠的瘤体体积和重量来进行评价。 结果发现气滞血瘀肺癌模型组小鼠出现聚堆、易激惹、形体消瘦,进食量和活动量减少,口周、爪甲、肛周及耳缘出现散在脉络瘀血等与临床证候类似的气滞血瘀证候表现,与对照组相比,气滞血瘀肺癌模型组小鼠的肿瘤体积增大,血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达升高,该模型在一定程度上与临床的发病特点相符合,具备可行性。

3 讨论和展望

病证结合动物模型是病证结合药理学研究体系中的关键一环,也是中医药现代化研究中的重要组成部分。

3.1 病证结合肺癌动物模型的关键问题

肺癌病证结合动物模型在当前已有的疾病造模的基础上虽取得了一定的研究进展与成绩,但同时也存在较多的问题与争议。 (1)造模思路单一,均采用“先证后病”的造模方法。 目前肺癌的病证结合动物模型基本都是在先根据中医的病因建立证候模型,然后再通过皮下注射LEWIS 肺癌细胞细胞复制肺癌疾病模型。 该方法可能存在人为所施加的干预因素对疾病模型造成改变,且病与证二者相互影响并非独立,增加了干扰因素从而降低了模型的稳定性和准确性。 “先证后病”的复合造模方法与中医临床的病证结合存在偏差。 临床上辨证常通过“望、闻、问、切”四诊合参全面收集患者的诊疗信息,而在肺癌病证结合动物模型中,研究者大多只通过对动物的简单观察或进行一些相关检测来收集证候信息,因而无法对肺癌临床证型进行客观的复制。 此外,“先证后病”的造模方法无法阐明不同肺癌病理类型与证型之间的关联性。 (2)缺乏客观、统一的模型评价标准。 在肺癌病证结合动物模型中,造模目前主要采用肿瘤组织病理学、血液学指标检测等手段,对动物的证候评价主要通过观察动物的一般行为、宏观表征及行为学,缺乏成熟完善的证候指标评价体系。 所以,目前学术界对病证结合动物模型的认可度不高。 (3)肺癌疾病模型单一,病证结合模型应用较少。 目前报道的肺癌病证模型中肺癌的疾病模型均是采用的肺癌异位移植模型,且细胞原位移植模型等其他肺癌疾病模型未见报道。 目前报道的肺癌病证结合模型有4 种,运用较多的为气阴两虚证、和脾气虚证,而“瘀血”致病理论在肺癌的发病中同样意义重大,但目前报道较少。 此外,肺癌本质上来说是本虚标实,虚实夹杂性疾病,而目前虚证与实证相结合的复合证型模型尚未见报道。

续表2

3.2 病证结合肺癌动物模型的发展思路

在未来肺癌病证结合动物模型的研究中,笔者认为:(1)造模思路与方法上认为可以尝试采用将病因和证因同时干预模型动物,从而达到病证同期的造模效果。 这样更为贴合临床上病证的演变规律,减少了干扰因素。 但同时也得注意多因素的同时干预可能会造成动物的死亡,从而降低模型构建的成功率。 同时可以引入单因素造模方法,即在不同病理类型的肺癌动物模型上动态观察动物的行为表征以及进行相关的指标检测等来判断“证”的类型,这样表现出来的“证”是疾病演变过程中自然的证候表现,符合中医临床“证”的概念,同时也能观察到不同病理类型的肺癌模型所表现出来的证的异同,并能在一定程度上能揭示肺癌不同证型与病理类型的关系。 (2)动物的物种存在差异,造模因素繁杂各异,不同证型之间界定存在分歧等问题,可借助临床指南的制定思路对动物的类别的选择及不同证型的干预手段进行标准化建设去实现肺癌病证结合动物模型的“病-证-症”统一。 (3)在模型评价方面,可以借助现代的系统生物学技术。系统生物学的“整合”思想与中医学的整体观念相切合,且弥补了传统四诊方法的不足与局限[58]。 当肺癌病证结合模型建立后,一方面收集小鼠的行为学表现特征,另一方面利用代谢组学、蛋白质组学、基因组学技术筛选模型动物不同证候的特异性生物标记物从而将中医的证候指标进行客观的量化,并可以此为药物靶点用以检验方药的有效性。 同时,“以方测证”反向验证评价肺癌模型缺乏针对性,且方证之间的紧密性不足,所以当使用“以方测证”反向验证法时,应当充分考虑到中药多靶点和一方可治疗对证的特点,因此需设置对照试验来增加研究结果的特异性。

综上所述,肺癌病证结合动物模型目前仍处于起步的摸索阶段,动物模型的总体稳定性较差,且模型构建操作技术不够成熟。 因此,必须在遵循动物模型必备的稳定性、可重复性、可行性、客观真实性等原则条件下,不断去优化现有的肺癌病证结合模型构建技术和方法,并借助现代分子生物学技术完善模型的评价标准,加大研发力度,提高肺癌病证模型的创新性,构建出符合中医临床辨证特点的高认可度的肺癌病证结合动物模型。