阿帕替尼对三阴性乳腺癌细胞凋亡的影响

张艺凡 唐喜军 王新帅

1.广东省珠海市中西医结合医院检验科，广东珠海 519000；2.河南科技大学第一附属医院肿瘤科，河南洛阳 471003

乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤[1]，我国每年新发病例约27 万[2-3]，其中三阴性乳腺癌（triplenegative breast cancer，TNBC）占12%～20%[4]。TNBC 患者对内分泌及Her-2 靶向治疗均不敏感，治疗难度大。研究发现，肿瘤血管生成主要依赖血管内皮生长因子和血管内皮生长因子受体（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR），VEGF 通过VEGFR-2正反馈作用刺激肿瘤血管生成，为肿瘤生长提供营养物质[5-6]。阿帕替尼作为新一代口服VEGFR-2 酪氨酸激酶抑制剂，其能竞争性抑制VEGFR-2 的ATP 结合位点[7-9]，抑制肿瘤血管生成[10-11]。本文旨在研究阿帕替尼对TMBC MDA-MB-468 细胞增殖、凋亡的影响，并进一步探索其潜在的调控机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 人乳腺癌MDA-MB-468 细胞株购自中国科学院上海细胞库。

1.1.2 药品与试剂 阿帕替尼（江苏恒瑞医药股份有限公司，生产批号：H20140103），MTT（美国Sigma-Aldrich公司，货号：M2128-100MG），AnnexinV-FITC/PI 凋亡检测试剂盒（美国BD 公司，货号：556547），Tranwell（美国Corning 公司，货号：CLS3783）。兔抗人Bcl-2（英国Abcam 公司，货号：ab32124）、兔抗人p65（英国Abcam 公司，货号：ab32536）、兔抗人GAPDH（英国Abcam 公司，货号：ab9485）、山羊抗兔二抗（英国Abcam 公司，货号：ab96899），超敏ECL 化学发光检测试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific 公司，货号A38554）。

1.1.3 器材 酶标仪（美国赛默飞世尔科技公司，型号：K3），流式细胞仪（美国BD 公司，型号：FACSCalibur），垂直凝胶电泳仪及配套设备（美国BIO-RAD 公司，型号：1658001），Chemical XRS+凝胶成像分析系统（美国BIO-RAD 公司，型号:1708265）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 置于37℃，5%CO2细胞培养箱中，按1∶3的比例分皿传代。

1.2.2 MTT 实验 制细胞悬液并接种于96 孔板。设置PBS 组、阿帕替尼组。每组复孔数为6。各阿帕替尼组各依次加入药物浓度分别为0.39、0.78、1.56、3.12、6.25、12.5、25、50、100、200 μg/ml 的完全培养基，PBS组加入含等药物体积PBS 的完全培养基。培养48 h，加入MTT，4 h 后，加入二甲基亚砜使紫色结晶溶解。酶标仪检测每孔吸光度值（OD 值），计算各组细胞存活率。用GraphPad 软件计算阿帕替尼的IC50值。

细胞存活率=（某药物浓度组平均OD 值-调零孔平均OD 值）/（PBS 组平均OD 值-调零孔平均OD 值）×100%。

1.2.3 流式细胞仪分析 制细胞悬液并接种于6 孔板。每组复孔数为6。1、10 μg/ml 阿帕替尼组分别加入药物浓度为1、10 μg/ml 的完全培养基，PBS 组加入含等药物体积PBS 的完全培养基，每组4 个复孔。48 h 后加入Annexin-V/FITC 和PI，进行流式细胞仪凋亡检测。用75%乙醇固定细胞，次日加入PI，进行流式细胞仪周期检测。实验独立重复3 次。

1.2.4 划痕愈合实验 细胞融合度达90%时，用200 μl枪头划痕，1、10 μg/ml 阿帕替尼组分别加入药物浓度为1、10 μg/ml 的完全培养基，PBS 组加入含等药物体积PBS 的完全培养基，每组4 个复孔。0、24 h 观察细胞迁移情况并拍照。实验独立重复3 次。

细胞迁移率=（0 h 划痕面积-24 h 划痕面积）/0 h划痕面积×100%。

1.2.5 Transwell 侵袭实验 制细胞悬液，取100 μl加入上室，将含20%FBS 的培养基加入下室。取药物浓度为3、30 μg/ml 的完全培养基50 μl 分别加入1、10 μg/ml 阿帕替尼组的上室，将含等药物体积PBS 的完全培养基50 μl 加入PBS 组的上室，每组4 个复孔。24 h 后用结晶紫溶液将细胞染色。观察侵袭细胞数量并拍照。实验独立重复3 次。

1.2.6 Western blot 实验 待细胞融合度达80%时，5、10 μg/ml 阿帕替尼组分别加入药物浓度为5、10 μg/ml 的完全培养基，PBS 组加入含等药物体积PBS 的完全培养基，每组4 个复孔。48 h 后提取蛋白。SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳，并转移至PVDF 膜，室温封闭，加入相应抗体。次日漂洗后加入辣根过氧化物酶标记的二抗，置于凝胶成像仪中检测目的蛋白条带。

1.3 统计学方法

应用GraphPad 软件处理数据分析作图，SPSS 21.0 版软件分析数据，计量资料用均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t 检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT 检测阿帕替尼对MDA-MB-468 细胞增殖的影响

各阿帕替尼组细胞存活率均低于PBS 组，差异有统计学意义（P ＜0.05），提示阿帕替尼可抑制细胞增殖。见图1。阿帕替尼作用MDA-MB-468 细胞48 h后的IC50值为10.674 μg/ml。PBS 组和1、5 及10 μg/ml阿帕替尼组的细胞数量及形态见图2。

2.2 流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期

1、10 μg/ml 阿帕替尼组细胞凋亡率均高于PBS组，差异有统计学意义（P ＜0.05），见图3。PBS 组与1、10 μg/ml 阿帕替尼组细胞周期分布比较，差异无统计学意义（P ＞0.05），见图4。

2.3 划痕愈合实验检测阿帕替尼对MDA-MB-468细胞迁移能力的影响

1、10 μg/ml 阿帕替尼组细胞迁移运动面积均少于PBS 组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见图5。

2.4 Transwell 侵袭实验检测阿帕替尼对MDA-MB-468 细胞侵袭能力的影响

1、10 μg/ml 阿帕替尼组细胞侵袭数量均少于PBS 组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见图6。

2.5 阿帕替尼对MDA-MB-468 细胞凋亡相关蛋白的影响

5、10 μg/ml 阿帕替尼组、p65 及Bcl-2 表达量均低于PBS 组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见图7。

3 讨论

乳腺癌主要分为Luminal A 型、Luminal B 型、Her-2 过表达型和TNBC 型[12]，其预后不尽相同[13]。TNBC 患者年龄轻，以绝经前女性居多，恶性程度较高[14-16]。越来越多的研究开始探索针对TNBC 的血管生成抑制剂及相关靶向药物的联合治疗方案[17-19]。阿帕替尼作为新一代血管生成抑制剂可抑制大鼠主动脉环生成，降低微血管密度[5,9,20]，临床试验[21-22]显示，阿帕替尼可延长肿瘤患者的生存期，并且毒性可控。

转录因子NF-κB 与肿瘤的发生发展密切相关[23-24]。p65 是NF-κB 家族最重要的亚基[25-26]。Bcl-2 作为重要的抗凋亡蛋白，接受p65 对其启动子区域进行调节。研究表明[27]，p65 的激活可促进Bcl-2 蛋白的表达。为进一步探究阿帕替尼对p65/Bcl-2 信号通路的影响，本研究通过Western blot 实验进行验证，结果显示，经阿帕替尼作用后，细胞的p65、Bcl-2 的表达量均有下降，这提示阿帕替尼抑制了p65/Bcl-2 信号通路的传导。

综上所述，阿帕替尼能抑制MDA-MB-468 的增殖，诱导凋亡，并抑制p65、Bcl-2 蛋白的表达。本研究为乳腺癌的诊断与治疗提供了一个新的方向和视角，或具有一定的应用价值或借鉴意义。