苦金片对脂多糖诱导巨噬细胞炎症反应的影响

刘 晴 朱春雪 刘承雨 王一成 何美娟 何嫣婕 黄汉鹏

江苏大学附属医院呼吸与危重症医学科，江苏镇江 212000

炎症是机体的一种防御性反应，过度的炎症反应会引起机体损伤[1-3]。炎症反应中单核巨噬细胞系统被激活，分泌肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、白细胞介素（interleukin，IL）等，参与组织损伤；上述炎症介质也可以反向激活巨噬细胞，加重炎症反应[4]。细胞自噬通过抑制促炎复合物、清除病原微生物等保护细胞，但过度的自噬也会加重机体损伤[5-7]。

急性咽炎起病急，进展快[8-9]，中医药疗效好、副作用少，已广泛用于急性咽炎的治疗[10-11]。苦金片清热利咽、消肿止痛，可用于急性咽炎，但相关机制不明[7-8]。本研究以脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激RAW 264.7 细胞建立炎症细胞模型，旨在探讨苦金片对细胞炎症损伤的保护作用及可能的机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

小鼠单核巨噬细胞（RAW264.7）购自上海酶研科技有限公司；LPS、caspase-3、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehy-drogenase，GAPDH）、TNF-α、膜型微管相关蛋白1 轻链3（light chain 3，LC3）、转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、自噬相关基因5（autophagy associated protein 5，ATG5）、p62 抗体购自美国Cell Signaling Technology公司（货号分别为#14011、#9662、#2118、#11948、#3868、#3711、#2630、#23214）；苦金片（上海医药集团青岛国风药业股份有限公司，生产批号：170903）；高糖DMEM 培养基、胎牛血清（Gibco 公司，美国）；RNA 逆转录试剂盒、实时定量聚合酶链反应试剂盒（TaKaRa 公司，日本，生产批号分别为AJG2280A、AJ91708A）；BCA 蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物技术有限公司，上海，生产批号：No.090120201103）；CCK8 试剂盒（日本同仁化学研究所，生产批号：PK513）。

1.2 研究方法

1.2.1 苦金片水提物的制备 苦金片置磷酸缓冲盐溶液中，60℃水浴4 h，3500 r/min 离心10 min（离心半径20 cm），0.22 μm 过滤，-20℃保存。

1.2.2 细胞培养 RAW264.7 细胞接种于含有10%胎牛血清的高糖DMEM 培养基中，37℃、5%CO2培养箱中培养。

1.2.3 CCK-8 法检测RAW264.7 细胞活力 RAW264.7细胞按每孔1×104个细胞/孔的密度接种于96 孔板培养。为观察苦金片对细胞存活率的影响，设立苦金片低、中、高剂量组（1、2、4 mg/ml）及空白组、对照组（加入等量培养基）、LPS（1 μg/ml）组，每组设置5 个复孔，每孔加入CCK8 试剂10 μl 后孵育1.5 h，检测450 nm 光密度（optical density，OD）值，细胞活性（%）=（给药组OD 值-空白组OD 值）/（对照组OD 值-空白组OD 值）×100%。实验重复5 次。

1.2.4 实验分组 RAW264.7 细胞按每孔1×105个细胞/孔的密度接种于6 孔板并分为三组：对照组、LPS组与苦金片组，每组设置5 个复孔。LPS 组予LPS（1 μg/ml）刺激12 h，苦金片组在LPS 刺激后予苦金片（1 mg/ml）刺激4 h，对照组不予特殊处理。

1.2.5 实时定量聚合酶链反应 Trizol 试剂提取细胞总RNA，逆转录为cDNA，反应条件为：预变性95℃，30 s，预变 性；95℃，5 s，60℃，30 s，40 个循 环；95℃，15 s，60℃，60 s，95℃，10 s，解离阶段。用于聚合酶链反应的引物序列为：IL-6：正向引物：5’-CTCCCAACAGACCTGTCTATAC-3’，反向引物：5’-CCATTGCACAACTCTTTTCTCA-3’；TNF-α：正向引物：5’-ATGTCTCAGCCTCTTCTCATTC-3’，反向引物：5’-GCTTGTCACTCGAATTTTGAGA-3’；TGF-β：正向引物：5’-CCAGATCCTGTCCAAACTAAGG-3’，反向引物：5’-CTCTTTAGCATAGTAGTCCGCT-3’；LC3Ⅱ：正向引物：5’-GCAGGCGGGTGATTATAGAG-3’，反向引物：5’-CCATTCACCAGGAGGAAGAA-3’；ATG5：正向引物：5’-CAACCG-GAAACTCATGGAAT-3’；GAPDH：正向引物：5’-GCTCAGAACACCTATGGGGA-3’，反向引物：5’-TCACAAGCTTCCCGTTCTCA-3’，反向引物：5’-ACCTGGCT-CCTCTTCTCTCC-3’。结果用2-ΔΔCt表示。实验重复3 次。

1.2.6 蛋白质免疫印迹法 各组细胞充分裂解后离心，收集总蛋白，加热变性后取20 μg 蛋白上样，凝胶电泳（80 V 30 min，110 V 1 h）后转膜（300 mA 2 h），室温封闭1.5 h，分别用GAPDH 抗体（1∶1000）、TNF-α抗体（1∶1000）、caspase-3 抗体（1∶1000）、LC3Ⅱ抗体（1∶1000）、p62 抗体（1∶1000）4℃过夜。清洗后加入二抗孵育（室温1.5 h），曝光，Image J 软件分析灰度。实验重复3 次。

1.3 统计学方法

采用Graphpad Prism 软件对所得数据进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，组间两两比较采用t 检验，多组间比较采用ANOVA 检验，组内比较采用SNK-q 检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 苦金片对LPS 诱导的RAW264.7 细胞活力的影响

与对照组比较，LPS 组细胞活力降低，差异有统计学意义（P ＜0.05）；苦金片各组细胞活力均高于LPS 组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。苦金片各组间细胞活力比较，差异无统计学意义（P ＞0.05），因此后续实验选择苦金片浓度为1 mg/ml。见表1。

表1 各组细胞活力比较（%，，n=5）

表1 各组细胞活力比较（%，，n=5）

注 与对照组比较，aP ＜0.05；与LPS 组比较，bP ＜0.05。LPS：脂多糖

2.2 苦金片对LPS 诱导的RAW264.7 细胞相关基因表达的影响

与对照组比较，LPS 组IL-6、TNF-α、TGF-β、ATG5、LC3ⅡmRNA 表达水平显著增加，差异有统计学意义（P ＜0.05）；苦金片组IL-6、TNF-α、TGFβ、ATG5、LC3ⅡmRNA 表达水平明显低于LPS 组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见表2。

表2 各组相关基因表达比较（，n=3）

表2 各组相关基因表达比较（，n=3）

注 与对照组比较，aP ＜0.05；与LPS 组比较，bP ＜0.05。LPS：脂多糖；IL：白细胞介素；TNF：肿瘤坏死因子；TGF-β：转化生长因子β；ATG5：自噬相关蛋白5；LC3Ⅱ：膜型微管相关蛋白1 轻链3Ⅱ

2.3 苦金片对LPS 诱导的RAW264.7 细胞相关蛋白表达的影响

与对照组比较，LPS组TNF-α、LC3 Ⅱ、p62 和caspase-3 蛋白表达增加，差异有统计学意义（P ＜0.05）；苦金片组TNF-α、LC3Ⅱ、p62 和caspase-3 水平明显低于LPS 组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见表3、图1。

表3 各组相关蛋白表达变化比较（，n=3）

表3 各组相关蛋白表达变化比较（，n=3）

注 与对照组比较，aP ＜0.05；与LPS 组比较，bP ＜0.05。LPS：脂多糖；TNF：肿瘤坏死因子；LC3Ⅱ：膜型微管相关蛋白1 轻链3Ⅱ

3 讨论

急性咽炎多因细菌、病毒感染所致，西医多用抗生素治疗，易产生耐药性。急性咽炎在中医学中被称为“急喉痹”，“咽喉口齿诸病，皆属于火”，以清热利咽止痛为治则[12-13]。

苦金片由苦地丁、金银花、黄芩、牛蒡子、玄参、桔梗、甘草组成，方中苦地丁清热解毒、凉血消肿，金银花疏散风热，黄芩清肺热，牛蒡子清热利咽，玄参增强苦地丁清热解毒的功效，桔梗载药上行，甘草调和诸药。现代药理研究发现，生物碱是苦地丁抗炎药效组分，其抗炎作用机制可能是抑制TLRs/NF-κB 信号通路[14-15]；金银花具有抗菌、抗病毒、抗炎、保肝利胆、降血糖、降血脂、增强免疫的作用[16-17]；黄芩[18-19]、牛蒡子[20-21]、玄参[22]抑制炎症介质释放。全方具有清热利咽、消肿止痛的功效。本研究发现，巨噬细胞经苦金片处理后，可明显对抗LPS 所致的IL-6、TNF-α、TGF-β mRNA 表达及TNF-α 蛋白水平上升，提示苦金片体外有良好抗炎作用。

细胞自噬与炎症反应密切相关，模式识别受体Toll 样受体的激活能够诱导细胞自噬的发生，细胞自噬又对炎症反应有调控作用，细胞自噬缺损是诱发炎症的一个重要因素[23-25]。LPS 诱导巨噬细胞自噬相关基因ATG5、自噬中间体LC3Ⅱ和p62 的积累，适度的自噬可以清除受损的细胞器，减轻炎症反应，而本研究中细胞自噬并未阻止炎症的发生，这可能是自噬体与溶酶体融合受阻或溶酶体降解受阻所致。将苦金片作用于LPS 处理后的RAW264.7 细胞，显著抑制了LPS 诱导的自噬中间体的增加及细胞活力的下降。此外，caspase-3 蛋白的表达显著降低，提示苦金片还具有一定的抗凋亡作用。

综上，本研究通过建立巨噬细胞炎症模型，除了证实苦金片的抗炎效用外，还发现苦金片具有抗凋亡作用、细胞自噬可能参与了苦金片的抗炎过程，这为苦金片用于多系统炎症疾病的治疗提供了理论依据。