胰高血糖素样肽-1对新生乳鼠脑缺血再灌注损伤的影响

李承燕 周 璇 唐兰芬 莫 波 陈银慧 陈巧媚 闫星羽 敖 当

1.广东医科大学附属医院儿科，广东湛江 524000；2.四川省医学科学院·四川省人民医院儿科，四川成都 610000

新生儿缺氧缺血性脑病（hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE）是足月新生儿死亡的重要原因[1]。脑缺氧再灌注损伤是新生儿HIE 主要病理生理改变。神经炎症反应、氧化还原失衡、钙超载、线粒体损伤等可能是神经元损伤机制[2-4]，治疗策略旨在减少神经元的死亡[5]。胰高血糖素样肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）有神经保护作用[6-7]，但机制不明，尚缺乏在新生儿HIE 中的研究。因此，本研究探讨GLP-1对脑缺血再灌注损伤后新生乳鼠海马组织炎症反应和凋亡的影响，为新生儿HIE 的临床治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

成年健康SD 大鼠（9 只，雌雄比例2∶1），广东医科大学实验动物中心提供，8～9 月龄，体重（200±20）g。

1.2 主要材料与仪器

兔抗核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）p65 抗体（美国Sigma 公司，批号：SAB5700780）；NF-κB（英国Abcam 公司，批号：ab16502）；诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）抗体（美国Sigma 公司，批号：SAB5700636）；肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）抗体（美国Sigma 公司，批号：AB1837P）；Caspase-3 抗体（美国Sigma 公司，批号：ABC495）；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（H+L）（中国Oster 公司，批号：A0208）；BCA 蛋白浓度测定试剂盒（中国Beyotime 公司，批号：P0011）；DeadEndTM荧光测定TUNEL 系统（普洛麦格生物技术有限公司，批号：G3250）；即用型免疫组化Max VisionTM2 试剂盒（福州迈新生物技术开发有限公司，批号：KIT-5920）；激光共聚焦显微镜（德国Leica 公司，型号：TCS SP8 X）；VersaDoc 成像系统（美国BIO-RAD公司，型号：3000）；利拉鲁肽注射液（丹麦诺和诺德公司，批号：BP52028）。

1.3 实验方法

1.3.1 动物模型构建及分组 成年健康SD 大鼠按2∶1雌雄鼠合笼交配后受孕雌鼠自然娩出乳鼠，乳鼠体重为（15±1）g。将18 只7 日龄SD 乳鼠编号后，依据随机数字表法分为对照组、模型组及治疗组，每组6 只。水合氯醛0.5 ml/10 g 腹腔注射麻醉后，解剖颈部暴露左颈总动脉。对照组仅暴露左颈总动脉，模型组及治疗组用血管夹夹闭左颈总动脉60 min 后恢复血流，缝合皮肤放回母鼠身边继续哺乳。术后治疗组给予利拉鲁肽注射液25 nmol/kg（0.1 ml）腹腔注射，对照组及模型组给予等量生理盐水（0.1 ml）腹腔注射，2 次/d，连续2 d。

1.3.2 神经行为障碍评分 缺血再灌注损伤48 h 后，按照Longa 法[8]对乳鼠进行神经行为障碍评分。0 分：无神经功能缺损症状；1 分：对侧前肢屈曲；2 分：行走时向对侧旋转且出现“追尾”现象；3 分：站立不稳，向对侧倾倒；4 分：不能自发行走，意识障碍。

1.3.3 TUNEL 法检测海马神经元凋亡细胞数 取各组乳鼠左侧海马组织制备石蜡切片，经脱蜡脱水后用多聚甲醛固定。灭活内源过氧化物酶活性后，依次加入5×TdT 平衡缓冲液、孵育缓冲液孵育。激光共聚焦显微镜检测凋亡细胞的荧光信号，检测海马CA1 区凋亡细胞数。

1.3.4 免疫组织化学法检测海马NF-κB 阳性细胞数制备海马组织的石蜡切片，将切片脱蜡水化后加NF-κB抗体孵育。PBS 液洗涤后用DAB 显色3 min，在显微镜下观察5 min，流水冲洗，苏木精复染。在倒置相差显微镜下观察各组海马CA1 区NF-κB 阳性细胞数。

1.3.5 Western blot 法检测海马组织NF-κB、TNF-α、iNOS、Caspase-3 蛋白的表达 取各组乳鼠新鲜左侧海马组织用RIPA 细胞裂解液裂解，以13 000 r/min离心15 min（离心半径为5.5 cm）。BCA 法定量蛋白质样品浓度。SDS-PAGE 电泳后剪胶转膜。用TBST 洗膜后分别加入一抗稀释液（NF-κB 1∶20 000、TNF-α 1∶3000，Caspase-3 1∶500 及iNOS 1/2000）孵育过夜；洗膜后加入辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（H+L）（1:5000）二抗稀释液孵育1 h；洗膜后加入显色液，避光显色至出现条带，X 线底片曝光，并以β-actin 作为内参，实验重复3 次。

1.4 统计学方法

采用SPSS 25.0 软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（）表示，组间比较采用t 检验。以P <0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组神经行为障碍评分比较

对照组神经行为障碍评分为0 分，模型组为（2.67±0.51）分，治疗组为（0.67±0.21）分；模型组神经行为障碍评分高于对照组，治疗组神经行为障碍评分低于模型组，差异均有统计学意义（P ＜0.05）。

2.2 各组海马神经元凋亡细胞数比较

对照组海马CA1 区神经元细胞形态结构完整，排列整齐，细胞核仁清晰，染色质分布均匀可见；模型组细胞分布稀疏，胞体肿胀或细胞膜破裂，细胞核固缩或碎裂常见；治疗组可见海马区细胞整齐紧密且层次清晰，细胞膜及细胞核完整，核碎裂少见，胞浆染色质均一，见图1A。模型组海马神经元凋亡细胞数高于对照组，治疗组海马神经元凋亡细胞数低于模型组，差异均有统计学意义（P <0.05），见图1B～C。

2.3 各组海马NF-κB 阳性细胞数比较

模型组NF-κB 阳性细胞数高于对照组，治疗组NF-κB 阳性细胞数低于模型组，差异均有统计学意义（P <0.05）。见图2。

2.4 各组海马组织NF-κB、TNF-α、iNOS、Caspase-3蛋白水平比较

模型组细胞核内p-NF-κB 蛋白水平高于较胞质NF-κB 蛋白水平，治疗组细胞核内p-NF-κB 蛋白水平低于胞质NF-κB 蛋白水平，差异均有统计学意义（P <0.05）。模型组TNF-α、iNOS、Caspase-3 蛋白水平高于对照组，治疗组TNF-α、iNOS、Caspase-3 蛋白水平低于模型组，差异均有统计学意义（P <0.05）。见图3。

3 讨论

GLP-1 是一种具有控制葡萄糖稳态作用的内分泌激素，由胰腺α 细胞和肠道产生[9]，但在神经元中广泛表达GLP-1 受体，如下丘脑、海马和锥体神经元[10-11]，提示GLP-1 可能在调节神经元活动中起重要作用[12-13]。研究显示，GLP-1 具有神经保护作用[14-16]，GLP-1 可抑制卒中大鼠的神经细胞氧化应激来减轻脑损伤[17]。本研究结果显示，GLP-1 减轻HIE 模型乳鼠的神经行为障碍。经GLP-1 治疗后，乳鼠海马区细胞整齐紧密且层次清晰，细胞膜及细胞核完整，核碎裂少见。但其机制尚需要进一步确定。

NF-κB 广泛存在于大脑神经细胞中，与脑缺血再灌注损伤的炎症反应相关[18-20]。研究发现，GLP-1 可通过抑制NF-κB 介导的炎症反应而产生对神经系统退行性病变的保护作用[21]。本研究结果显示，脑缺血再灌注后p-NF-κB 蛋白表达量明显增高，提示NFκB 向细胞核移位；GLP-1 治疗后，NF-κB 阳性神经元及细胞核内NF-κB 的表达量增高不明显，且海马神经元的凋亡数量减少，提示GLP-1 可通过抑制NF-κB的激活及核转移来减少海马神经元凋亡。

激活NF-κB 信号是导致炎症的早期事件[22-23]，通过多种途径促进炎症因子产生，如TNF-α 和iNOS[24]。TNF-α 在炎症反应和加重神经元损伤中起着重要作用，过度表达时会导致细胞坏死或凋亡[25]，从而激活Caspase-3 加快细胞凋亡[26]。同时，缺血再灌注损伤可诱导iNOS 表达增加，促进NO 的产生，导致神经元凋亡。本研究结果显示，GLP-1 治疗后TNF-α、Caspase-3和iNOS 蛋白表达降低，提示GLP-1 可能抑制缺血神经元的NF-κB 通路来减轻神经元的炎症反应及神经元凋亡。

综上所述，GLP-1 能改善乳鼠缺血再灌注损伤后的神经行为障碍。GLP-1 可能通过抑制NF-κB 介导的炎症反应来抑制神经元凋亡，发挥对乳鼠脑保护作用。目前还需要进一步的实验和临床研究来评价利拉鲁肽注射液作为新生儿HIE 治疗的有效性。