双歧杆菌通过IL-6介导EMT对HCT116结肠癌细胞侵袭转移影响

杜 恒 吴安定 张红英 余 洁 简 辉

湖北省黄冈市中心医院胃肠外科，湖北黄冈 438000

研究表明，肿瘤炎症微环境可分泌炎症因子诱导上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）发生，促进其发生侵袭转移[1-2]。白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）是肿瘤相关巨噬细胞重要的炎症、免疫调节介质，与肿瘤细胞生长、凋亡、增殖密切相关[3-4]。已有研究表明IL-6 可诱导胃癌、肝癌EMT 的发生[5-7]。双歧杆菌体通过黏附和定植于肠道黏膜上皮细胞，发挥抗肿瘤、抑菌、抗氧化、抗感染、免疫应答等多种作用[8]，但其对结肠癌细胞炎症环境及EMT 的影响仍不是十分清楚。本研究通过将双歧杆菌与HCT116 结肠癌细胞在体外进行共培养，探讨双歧杆菌对HCT116结肠癌细胞炎症微环境及EMT 的影响，为结肠癌复发转移的治疗提供一定的理论参考。

1 材料与方法

1.1 主要材料与仪器

结肠癌细胞株HCT116（iCell 公司，货号：iCellh071）；双歧杆菌（北京北纳创联生物技术研究院，货号：BNCC180715）；IL-6 抗体（Abcam 公司，货号：ab23 3706）；上皮钙黏素抗体（Abcam 公司，货号：ab40772）；神经钙黏素抗体（Abcam 公司，货号：ab18203）；GAPDH抗体（Abcam 公司，货号：ab37168）；Cy3 标记山羊抗兔（Aspen 公司，货号：AS-1109）；BCA 蛋白质浓度测定试剂盒（Aspen 公司，货号：AS1086）；SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒（Aspen 公司，货号：AS1086）；抗荧光淬灭封片剂（武汉阿斯本生物技术有限公司，货号：AS1089）；倒置显微镜（OLYMPUS 公司，IX51 型号）；成像系统（Q-IMAGING 公司，MicroPublisher 型号）；Transwell 板（8 μm，Corning 公司，3422 型号）。

1.2 细胞培养

HCT116 结肠癌细胞培养于含10%胎牛血清的McCOY’s 5A 培养基中，在37℃，5%CO2条件下传代培养。

1.3 细胞分组

将HCT116 细胞按2×105个/孔的方式接种于6 孔板上，过夜待细胞贴壁后，双歧杆菌组将培养基换成含80 μg/ml 双歧杆菌的完全培养基，对照组采用普通完全培养基。培养48 h 后，对各组细胞进行相应检测。

1.4 Western blot 检测

对两组进行裂解，收集总蛋白，用BCA 试剂盒测定蛋白浓度，在10% SDS-PAGE 胶孔中加入等量总蛋白进行电泳，再经湿转法转移目的蛋白至PVDF 膜上，加入稀释的IL-6 抗体（1∶1000）、上皮钙黏素抗体（1∶1000）和神经钙黏素抗体（1∶1000），经TBST 缓冲液清洗后，加入二抗稀释液杂交（1TBST5000），ECL 显影、定影，最后用AlphaEaseFC 软件处理系统分析目标带的光密度值。每组3 个复孔。

1.5 免疫荧光技术检测IL-6、上皮钙黏素和神经钙黏素的表达及定位

将两组细胞接种放置灭菌盖玻片的6 孔板内，2×105个/孔，每组3 个复孔。按照“1.3”所述处理细胞后，用4%多聚甲醛固定细胞，0.5%Triton 打孔，5%牛血清白蛋白封闭，再加入IL-6 抗体（1∶50）、上皮钙黏素抗体（1∶200）和神经钙黏素抗体（1∶200），4℃孵育过夜，脱色摇床晃动洗涤，磷酸盐缓冲液清洗，Cy3 标记的二抗（1∶50）室温孵育50 min，磷酸盐缓冲液清洗，加入50～100 μl 的DAPI 染液，室温孵育5 min，磷酸盐缓冲液清洗，抗荧光淬灭剂封片，荧光显微镜观察。

1.6 细胞划痕试验和Transwell 小室实验

1.6.1 细胞划痕实验 6 孔板每孔中加入2 ml 约有5×105个HCT116 细胞的培养基，待细胞铺满孔板底部90%后，用10 μl 无菌移液枪枪头划出均匀直线，用无菌磷酸盐缓冲液漂洗划下的细胞，加入2 ml 完全培养基，在倒置显微镜下拍照并记为0 h 结果；继续培养24 h 后于同一位置观察并拍照，记为24 h 结果。划痕愈合率=（0 h 划痕宽度-24 h 划痕宽度）/0 h 划痕宽度×100%。

1.6.2 Transwell 小室实验 按照1∶3 比例用培养基稀释基底膜基质，于Transwell 小室中滴加50 μl 稀释液，迅速铺匀后放入培养箱中干燥备用。制备含105个/ml 密度的细胞悬液，滴加200 μl 细胞悬液到Transwell 小室上室中，加入500 μl 含10%胎牛血清的完全培养基到Transwell 小室下室，将小室放入24 孔板中。静置培养48 h 后，小室取出后用磷酸盐缓冲液清洗培养基，用棉签小心拭去上室中的胶和细胞，用结晶紫染液染色下室细胞10 min，磷酸盐缓冲液清洗除去染料，于倒置显微镜下拍照小室下室处细胞，随机挑选5 个视野计算侵袭细胞数。

1.7 统计学方法

采用SPSS 22.0 对所得数据进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，组间比较采用t检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组IL-6、上皮钙黏素、神经钙黏素蛋白表达水平比较

Western blot 检测结果显示，双歧杆菌组上皮钙黏素蛋白表达水平高于对照组，IL-6、神经钙黏素蛋白表达水平低于对照组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见图1。

2.2 两组免疫荧光分析结果

免疫荧光检测结果显示，标记有Cy3 红荧光的IL-6、上皮钙黏素和神经钙黏素蛋白定位于细胞膜上，与对照组比较，双歧杆菌组上皮钙黏素荧光明显，IL-6、神经钙黏素荧光微弱。见图2。

2.3 两组细胞划痕试验和Transwell 小室实验结果比较

24 h 后，两组均发生划痕愈合现象，定量分析结果显示双歧杆菌组划痕愈合率高于对照组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见图3。Transwell 小室实验结晶紫染色及定量分析结果显示双歧杆菌组侵袭细胞数少于对照组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见图4。

3 讨论

肠道菌群可参与免疫应答和维持内环境，其失调常引起肠道微环境改变，如肠道慢性炎症的形成，并且肠道炎症微环境中的多种促炎性细胞因子，如IL-6、肿瘤坏死因子-α、转化细胞因子-β 等，与结直肠癌的发生发展及侵袭转移密切相关，但具体机制少见到深入研究[9-11]。本研究结果显示，结肠癌细胞HCT116 与双歧杆菌共培养后，其IL-6 蛋白表达水平明显下降，提示双歧杆菌可抑制HCT116 细胞的IL-6 分泌，与以往研究类似[12]。张迎娣等[13]研究发现，采用双歧杆菌喂养葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎小鼠，可减轻其急性期肠道炎症反应，改善肠道炎症微环境。李小伟[14]研究表明，双歧杆菌口服胶囊可减轻结直肠患者术后炎症反应，其机制可能与双歧杆菌能改善肠道微环境有关。本研究显示，双歧杆菌下调结肠癌细胞HCT116的IL-6 蛋白水平，提示双歧杆菌可能具有减轻结肠癌肠道炎症反应的作用。

目前研究表明，多数上皮细胞癌在侵袭转移过程中发生了EMT，包括肝癌、乳腺癌、结直肠癌等[15-18]。肿瘤炎症微环境与肿瘤细胞通过一系列程序促使IL-6 等的释放，相应的促炎性细胞因子可激活EMT的信号通路靶点，启动肿瘤细胞侵袭转移发生[19-21]。结肠癌是炎症相关肿瘤，慢性炎症是结肠癌发生发展的重要因素[22-23]。Dehai 等[24]发现将肺腺癌细胞与M2 巨噬细胞进行共培养后，IL-6 表达显著上升，且IL-6 可促进肺腺癌细胞EMT 发生，介导肺癌细胞侵袭转移，提示IL-6 与EMT 密切相关。本研究结果显示，双歧杆菌与结肠癌细胞共培养后，IL-6 表达下降，同时EMT 上皮标志物上皮钙黏素显著上调，间质标志物神经钙黏素表达下调，伴随HCT116 结肠癌细胞侵袭转移能力显著下降，提示双歧杆菌可通过调节IL-6 分泌，抑制EMT 生物标志物表达和效应发生。王伟杰等[25]发现双歧杆菌完整肽聚糖可抑制EMT 进程，减弱结肠癌细胞侵袭转移能力，与本研究结果基本一致。因此双歧杆菌可能通过调节炎症因子的释放，减轻炎症反应，抑制EMT 进程，降低HCT116 细胞侵袭转移能力，发挥抗肿瘤效应。

综上，本研究在体外实验中发现双歧杆菌可通过下调IL-6 表达抑制炎症反应和EMT，减弱HCT116结肠癌细胞侵袭转移能力，为临床结肠癌治疗提供新的思路，但不足之处在于未对双歧杆菌组双歧杆菌处理的进一步优化，同时缺少动物实验研究。