CCK-8与MTT法检测左归丸含药血清干预BMSCs增殖条件的比较

刘飞祥 谭峰 樊巧玲 李星 叶素敏 张明玥 柴毅 麦聪英 吴丹

南京中医药大学中医学院·中西医结合学院，江苏 南京 210023

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是骨髓中的一类祖细胞，具有自我复制及向成骨细胞、成脂细胞、成软骨细胞等方向分化的能力[1-2]。左归丸(Zuoguiwan，ZGW)出自《景岳全书》，由鹿角胶、山药、川牛膝、山茱萸、龟板胶、熟地、菟丝子和枸杞子八味药物组成，具有滋阴补肾、填精益髓的作用[3]。研究表明[4-6]，ZGW含药血清能够通过调节骨保护蛋白/核因子κB受体激活因子配体/核因子κB受体活化因子等多条信号通路，促进BMSCs的增殖。在观察ZGW含药血清促进BMSCs增殖作用的实验中，常需要用MTT法或CCK-8法对其进行增殖能力检测。然而相关文献报道的两种方法，在检测大鼠BMSCs增殖时的所采用的细胞接种密度差异较大，检测波长不一，孵育时间不同，给实验开展造成了一定困难[7-9]。鉴于此，笔者就两种方法在检测ZGW含药血清干预BMSCs增殖时所需要的最佳实验条件进行了比较，以期为相关人员提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物：10只一周龄SPF级SD乳大鼠和20只8周龄SPF级SD大鼠均由南京市青龙山动物繁殖中心提供，合格证号为SCXK(SU)2017-0001，8周龄SPF级SD大鼠在南京中医药大学动物实验中心喂养。本次动物实验研究获得南京中医药大学动物伦理委员会的同意(伦理号：201803A002)。

1.1.2仪器与试剂：MTT试剂盒(江苏凯基)，CCK-8试剂盒(日本同仁化学)，α-MEM(美国Gibco)，FBS胎牛血清(美国Gibco)，双抗(美国Gibco)，二甲基亚枫(DMSO，美国Sigma)，酶联免疫检测仪(美国 PerkinElmer)。

1.2 方法

1.2.1ZGW冻干粉的制作：熟地黄、山药、山茱萸、枸杞子、川牛膝、菟丝子、龟甲胶和鹿角胶购买于南京中医药大学国医堂。ZGW冻干粉的制作，即中药(龟甲胶和鹿角胶除外)粉碎后分别煎煮2 h，然后过滤浓缩，洋化龟甲胶和鹿角胶，上Freeze Dryers冻干机-50 ℃干燥48 h，低温干燥保存。

1.2.2含药血清的制备：20只8周龄SPF级SD大鼠常规饲养7 d后分别给予ZGW(4.6 g/kg冻干粉)连续灌胃7 d。末次给药2 h后，经腹主动脉取血，以3 000 r/min，离心 15 min，然后血清过滤除菌、灭活，-80 ℃保存备用。2.5% ZGW含药血清的配制：2.5 mL ZGW大鼠血清，86.5 mL α-MEM培养液，10 mL FBS，1 mL青链霉素。

1.2.3BMSCs的提取：乳大鼠颈椎脱臼法处死，取胫骨和股骨，暴露骨髓腔，断端朝下放入无菌 EP管中，12 000 r/min离心30 s；离心管中加入10% α-MEM培养液，200 μm滤网过滤；然后红细胞裂解液冰上裂解10 min；10% α-MEM培养液洗涤2次；然后接种于6孔板中，并在6 h、24 h后进行换液，之后每2～3 d更换新鲜的培养液，此时标记为P0。P0细胞在12 d后即融合至80%～90%，可进行传代。

1.2.4波长检测：按照1×104/孔的密度将P3细胞分别接种于2个96孔板中(MTT板，CCK-8板)，设置实验组4个复孔，4个不含细胞的空白对照孔，ZGW含药血清培养48 h后，MTT板加100 μL/孔MTT液，37 ℃孵育4 h，CCK-8板加20 μL/孔CCK-8液，37 ℃孵育3 h。检测前，MTT板吸去上液，加DMSO 150 μL/孔，37 ℃恒温震荡10 min，以充分溶解甲臢。孔中加入的MTT液和CCK-8液的量是根据各说明书中试剂与孔中培养液体积的比值进行计算。两组送酶联免疫检测仪以410、430、450、470、490、510、530、550、570、590 nm的波长检测。

1.2.5灵敏度检测：按照每孔8×104、4×104、2×104、1×104、0.5×104、0.25×104、0.1×104、0的浓度将P3细胞分别接种在MTT板、CCK-8板中(96孔板)，每组设5个复孔。ZGW含药血清培养48 h后，MTT组加入MTT溶液100 μL，37 ℃孵育4 h，测定前吸去培养液，每孔加150 μL DMSO，37 ℃恒温震荡10 min；CCK-8组每孔加入20 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育3 h后送酶联免疫检测仪，波长分别为550 nm(MTT法)、450 nm(CCK-8法)。将每个细胞密度下所得的OD与其前一个密度条件下所得OD值相比，对所得的比值进行统计分析，从而观察在细胞密度翻倍的情况下，两种方法的灵敏度情况。

1.2.6孵育时间：按照每孔1×104、0.5×104、0.25×104、0的细胞密度将P3细胞接种于6个96孔板中，每组设置8个复孔，ZGW含药血清培养48 h后，分别加入MTT和CCK-8试剂，在孵育0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、5、6、7、10 h时进行检测，同一细胞浓度每次检测4个复孔，波长分别为550 nm(MTT试剂)、450 nm(CCK-8试剂)。

1.2.7生长曲线：取指数生长期的P3细胞，按照每孔0.05×104、0.1×104、0.25×104、0.5×104、1×104的细胞密度接种于8块96孔板中，每组设4个复孔，在ZGW含药血清干预1、2、3、5、7、9、11、13 d后，分别加入MTT和CCK-8试剂，孵育4 h和3 h后，以相应的波长进行检测。

2 结果

2.1 最佳波长

在细胞密度同为1×104/孔时，MTT法检测的OD值在550 nm达到峰值，并从550 nm处其OD值向两侧逐渐递减；CCK-8法检测的OD值在450 nm达到峰值，并从450 nm处其OD值向两侧逐渐递减(图1)。

2.2 灵敏度检测

在特定波长条件下，与CCK-8法相比较，在细胞密度为0.1×104/孔、2×104/孔、4×104/孔和8×104/孔时，MTT法对细胞在翻倍时OD值增加的响应量无明显变化，差异统计学意义(P>0.05)。与CCK-8法相比较，在细胞密度为0.25×104/孔、0.5×104/孔和1×104/孔时，MTT法对细胞在翻倍时OD值增加的响应量明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)(图2，表1)。

图2 不同细胞密度下两种试剂所检测的OD值Fig.2 OD values of CCK-8 and MTT assay under different cell density

表1 不同细胞密度下两种试剂的灵敏度Table 1 Sensitivity of CCK-8 and MTT assay under different cell density

2.3 孵育时间

在细胞密度为0.25×104/孔、0.5×104/孔和1×104/孔时，CCK-8法与MTT法检测的OD值均与孵育时间呈正比。在细胞浓度为1×104/孔时，CCK-8法所测的OD值即将超过标曲，而在孵育时间超过10 h后，不同细胞密度下所得的OD值也超过标曲(图3A)，这说明CCK-8法试剂孵育时，细胞密度应不超过1×104/孔，同时孵育时间应控制在一定范围内。而MTT法在检测10 h后，检测的OD值趋势持续上升(图3B)。

图3 CCK-8法(A)与MTT法(B)的孵育时间Fig.3 Incubation time of CCK-8 (A) and MTT (B) assay

2.4 增殖曲线

采用CCK-8法检测，在增殖的前7 d，BMSCs密度为0.05×104/孔和1×104/孔条件时，ZGW含药血清干预后细胞的增长趋势较慢，OD值幅度变化较小；而细胞密度为0.25×104/孔和0.5×104/孔条件时，ZGW含药血清干预后细胞的增长趋势较快，OD值幅度变化较大，在第7天OD值达酶标仪上线，提前进入平台期；而细胞密度为0.1×104/孔时，经含药血清干预后的BMSCs在前5 d缓慢增殖，从第7天开始呈对数生长，第11天时进入平台期，生长曲线呈S形(图4A)。

图4 CCK-8法(A)和MTT法(B)检测BMSCs的增殖实验Fig.4 Proliferation of BMSCs detected by using CCK-8 (A) and MTT (B) assay

采用MTT法检测，BMSCs密度为0.05×104/孔条件时，经ZGW含药血清干预后的BMSCs在整个观察期内增殖速度非常缓慢，至观察末期未进入增长平台期；在细胞密度为0.1×104/孔条件下，虽然在第5天开始，细胞成快速增长，但细胞生长第13天后尚未进入平台；BMSCs密度为0.5×104/孔和1×104/孔条件时，BMSCs增殖速度快，增长幅度较大，在第7天进入平台期，生长曲线呈S形；BMSCs密度为0.25×104/孔时，细胞传代后第1～3天，吸光度变化不大，在第4～11天增势明显，在第11～13天进入平台期，生长曲线呈S形(图4B)。

3 讨论

BMSCs主要存在于骨髓中，决定骨的生长发育和代谢。课题组前期关注左归丸对BMSCs的增殖和分化研究[10-11]，然而在对BMSCs增殖实验中，发现文献报道中CCK-8与MTT对细胞接种的密度、孵育时间、灵敏度存在一定争议，不利于实验的开展。因此开展本次研究，以期为相关人员提供一定的参考。

CCK-8试剂生成的甲臢物的数量与活细胞的数量呈正比[12]。该试剂无细胞毒性，随着孵育时间的增加，细胞中的酶不断产出甲臢物，OD值也会不断增大，直至达到酶标仪检测的上限。若检测间隔时间较长，则所得OD值前后误差较大，影响实验准确性。MTT法的晶体生成量与活细胞数量和细胞活化状态呈线性关系[13]。MTT法在孵育结束后，需要加入DMSO溶解沉积在细胞中的甲臢晶体。由于MTT试剂有细胞毒性，因此新生结晶较少，且溶解甲臢的速度较慢，所以其OD值在一定时间内幅度增加有限，对实验结果影响较小。

在特定波长下测定的甲臢物和甲臢晶体有其特定的波长，在此波长条件下，甲臢物和甲臢晶体能吸收做多的光能量[14]。本研究中CCK-8法与MTT法在检测左归丸含药血清干预BMSCs增殖时，其OD值趋势分别是从450 nm和550 nm处向两侧递减。因而，可以确定550 nm和450 nm分别是MTT法与CCK-8法在检测BMSCs增殖时的最佳测量波长。

灵敏度是反映一种方法对单位浓度或单位量待测物质变化所致的响应量变化程度[15]。本研究发现，当细胞密度过低(≤0.1×104/孔)或细胞密度过高(>1×104/孔)时，CCK-8法和MTT法对细胞在翻倍时OD值的变化均不敏感，响应量变化较小。当细胞密度范围在0.1×104/孔至1×104/孔时，MTT法对细胞密度在翻倍时的响应量较大，灵敏度较高，而CCK-8法对细胞密度在翻倍时的响应量较小，灵敏度相对较差，二者具有明显差异。因此以往通过OD值的大小来判断CCK-8 法比 MTT 法对细胞浓度变化更加灵敏的说法有待商榷[16]。

BMSCs细胞体积较大，由于96孔板孔面积有限，且增殖实验时间干预跨度较长，而细胞铺满96孔板需要7 d以上，细胞密度过高会造成细胞提前进入平台期而出现假阳性结果，密度过低会导致孵育时间过长而进入平台期的时间延长，所以细胞的接种密度对于正确反映细胞的生长趋势尤为关键[17]。本研究认为，当BMSCs接种密度分别高于0.25×104/孔和0.5×104/孔时，所测OD值因超酶标仪上限，两种试剂均提前出现假S型曲线。当BMSCs接种密度0.1×104/孔时，由于细胞前期生长缓慢，后期持续生长，进入平台期延迟，也不能正确反映出细胞的生长趋势。因此，使用CCK-8和MTT试剂时，只有当细胞接种密度分别控制在0.1×104/孔至0.25×104/孔之间和0.25×104/孔左右时，才能较好地反映出左归丸含药血清干预BMSCs的增殖趋势。

综上所述，在研究左归丸含药血清干预BMSCs增殖实验中，使用CCK-8试剂时，检测波长为450 nm，孵育时间为3 h，细胞接种密度为0.1×104/孔；使用MTT试剂检测时，波长为550 nm，孵育时间为4 h，细胞接种密度以0.25×104/孔为最佳。MTT法对细胞密度在0.1×104/孔至1×104/孔时翻倍的响应量较大，灵敏度较高，优于CCK-8法。