森登-4汤治疗骨性关节炎的靶点筛选及验证

金刚 徐艳华 郝俊生 金英 乌云达来 赵巴根那 白红柱 吉白格力玛 额希宝力道

1.内蒙古民族大学附属医院，内蒙古 通辽 028007 2.蒙古国国立医科大学国际蒙医学院，蒙古国 乌兰巴托 15160 3.内蒙古自治区通辽市市场检验检测中心，内蒙古 通辽 028000 4.内蒙古自治区赤峰市翁牛特旗中蒙医院，内蒙古 赤峰 024500 5.内蒙古自治区赤峰市翁牛特旗旗医院，内蒙古 赤峰 024500

骨性关节炎(osteoarthritis，OA)的患病率呈逐年增长的趋势[1-2]，影响患者身心健康及生活质量，其预防和治疗更加受到重视。治疗具有多样性，蒙医药学诊疗理念以整体观理论为指导，多元化、多成分、多靶点为独特的优势。OA蒙医学认为该病属于“关节协日乌苏病”范畴，视发病原因与体内三根七素之相对平衡状态失调，希日衰减而巴达干、赫依增盛，胃火减弱，筋肉骨骼处于逐渐衰弱之状态有关[3-4]。森登-4汤作为蒙药经典良方组方简洁合理，对关节炎、黄水病等症的治疗具有其独特的药效，被收载于中华人民共和国卫生部药品标准[5-6]。

网络药理学作为一种新型的药物研究模式，整合各种药物和生物数据库，利用生物信息学分析和构建药物-基因靶点蛋白-疾病的网络预测模型，预测药物作用靶点[7-8]，具有前沿性、系统性、整体性的特点[9]。结合以上中药网络药理学方法及特点，复方蒙药具有与中药相似的特点，强调“药有个性质之特长，方有合群之妙用”的组合应用形式，重视“君、臣、佐、使”的组合效果，因此借鉴中药网络药理学预测手段应用于复方蒙药成分及疾病靶点对接研究中，在此网络药理学是中药及蒙药与现代医学嫁接的重要桥梁[10-11]。它适合复方蒙药多成分、多靶点作用的特点，本文首先通过网络药理学筛选并阐明森登-4汤对OA的作用靶点，为传统蒙药寻找新的作用靶点提供理论依据，进一步采用免疫印迹法对靶点蛋白进行验证，为网络药理学的筛选方法进行考察，也为探讨森登-4对OA的作用机制提供新的研究思路与方向，填补蒙药结合网络药理学进行实验研究的空缺。

1 材料与方法

1.1 动物

6月龄日本大耳白家兔，购自辽宁长生实验动物中心。合格证号：SCXK(辽)-2015-0001。

1.2 试剂及仪器

主要试剂：森登-4汤(内蒙古民族大学附属医院蒙药制剂室，中国)；Matrix metalloproteinases 13、tissue inhibitors of metalloproteinase 9抗体(abcam公司，美国)。主要仪器：DM2500光学显微镜(Leica公司，德国)；FUSION FX凝胶成像系统(北京五洲东方科技发展有限公司，中国)；DYCZ-24DN蛋白质电泳仪(北京六一仪器厂，中国)。

1.3 数据库及软件平台

TCMSP数据库、DISgeNET、PharmGkb、OMIM数据库、NCBI等数据库、OmicShare云平台、Cytoscape3.7.2软件。

1.4 网络药理学方法筛选森登-4治疗OA的潜在靶点

1.4.1森登-4中单味药相应化合物成分及靶点筛选[12]：本研究通过TCMSP数据库、中国知网获得栀子、诃子、川楝子、文冠木化合物信息，并以ADME条件为OB≥30%，DL≥0.18为条件筛选化合物，利用PubChem数据库，保存化合物标准的Canonical SMILES格式。将SMILES格式文件导入Swiss target predictionn平台，即为森等-4汤主要成分的靶点，得到药物-成分-靶点关联数据。

1.4.2OA疾病相关靶点的检索及获取[13-14]：通过DISgeNET、PharmGkb、OMIM数据库、NCBI等数据库，以“Osteoarthritis”为关键词，获得与OA疾病相关的靶点基因，并对靶点进行合并，除去重复，最终获得OA总靶点基因。

1.4.3森登-4治疗OA的潜在靶点筛选：将“1.4.1”化合物靶点与“1.4.2”OA相关靶点输入OmicShare云平台，进行映射匹配，取重复靶点，筛选出森登-4汤与OA的共标靶点，此为最终获取的森登-4汤治疗OA潜在靶点。

1.4.4“活性成分-靶点-通路”网络构建：通过Merge工具将森登-4汤活性成分、潜在靶点、代谢通路数据导入Cytoscape3.7.2软件，构建网络图。

1.5 运用动物模型验证森登-4治疗OA的相关靶点蛋白

1.5.1动物模型制备及给药干预：采用改良Hulth法建立家兔OA模型[15]。将建立模型家兔分为模型组、实验组，每组8只，另有假手术组8只。实验组灌胃给予森登-4汤水煎液每日0.43 g/kg，假手术组和模型组给予蒸馏水，持续用药治疗4周。取关节软骨组织检测相关蛋白。

1.5.2Westernblot法检测家兔患侧膝关节软骨组织MMP-9、MMP-13蛋白表达[16]：取家兔患侧膝关节软骨组织，提取总蛋白，进行SDS-PAGE凝胶电泳，蛋白质转膜，相应一抗孵育，二抗孵育，化学发光试剂显色，以GAPDH为内参蛋白，对各样品蛋白质表达的灰度条带采用凝胶成像系统进行计分统计。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 森登-4中单味药相应化合物成分及靶点

通过TCMSP数据库、中国知网获得森登-4中单味药栀子、诃子、川楝子、文冠木相应的化合物信息，并以ADME条件为OB≥30%，DL≥0.18为条件筛选化合物得到37个，再利用PubChem数据库保存化合物标准的Canonical SMILES格式。

2.2 森登-4汤治疗OA潜在靶点

基于Swiss target predictionn平台剔除重复项后得到739个基因靶点。通过DISgeNET疾病数据库中骨性关节炎的相关靶点进行比对，最终筛选出30个潜在靶点，见图1和表1。

图1 森登-4治疗骨性关节炎靶点韦恩图A：森登-4相关靶点；B：骨性关节炎，膝关节；C：骨性关节炎，髋关节；D：骨性关节炎，肘关节Fig.1 Venn diagram of Sundon-4 targets in the treatment of osteoarthritisA: Sundon-4 correlation target; B:Osteoarthritis, Knee; C: Osteoarthritis, hip joint; D: Osteoarthritis, elbow joint

表1 森登-4治疗骨性关节炎作用靶点Table 1 Therapeutic targets of Sundon-4 in the treatment of osteoarthritis

2.3 森登-4汤治疗OA“活性成分-靶点-通路”网络构建

将活性成分、作用靶点、KEGG通路信息导入Cytoscape3.7.2软件中构建网络图。筛选核心成分和靶点，结果显示，基质金属蛋白酶9(MMP9)、基质金属蛋白酶13(MMP13)、环加氧酶2(PTGS2)、雌激素受体1(ESR1)、雌激素受体2(ESR2)、雄激素受体抗体(androgen receptor，AR)、肿瘤坏死因子(TNF)、血管内皮生长因子 A(VEGFA)、基质金属蛋白酶2(MMP2)、核因子KB1(NFKB1)、白细胞介素-6(IL-6)、过氧化物酶体增殖因子活化受体A(PPARA)等靶点为核心靶点，从而可以看出森登-4汤多成分-多靶点-多通路的作用特点。见图2。

图2 “森登-4单味药-活性成分-靶点-通路”网络Fig.2 “single drug -active ingredient-target -pathway” network注：圆形节点代表单味药，六边节点代表活性成分，四边节点代表作用靶点，长方形节点代表作用通路

2.4 Western blot法检测家兔软骨组织MMP-9、MMP-13蛋白表达变化

与模型组比较，实验组MMP-9、MMP-13蛋白表达下调，差异有统计学意义(P<0.01)，见图3。

图3 家兔膝关节软骨组织MMP-9、MMP-13蛋白表达比较A：假手术组；B：模型组；C：实验组Fig.3 Comparison of protein expression between MMP-9 and MMP-13 in the knee joint cartilage of rabbitsA: Sham-operated group; B: Model groups; C: Experimental group

3 讨论

蒙药及其复方具有多成分、多途径、多靶点协同作用的独特之处，起到影响多条通路及靶点的作用[17]，本研究在前期研究者提出“多组分、多目标”是蒙医传统医学的特点[18]，通过本研究阐明森登-4汤核心成分靶点为MMP13、MMP9、MMP1、MMP2、PTGS2、ESR1、ESR2、AR、TNF、VEGFA、NFKB1、IL-6、PPARA等，在此结论下采用更接近人类关节炎的模型，运用Western blot法对其中的MMP13、MMP9蛋白进行验证，得到相关结论，森登-4汤明显下调OA疾病过程中关节软骨组织MMP13、MMP9蛋白。这就验证了网络药理学筛选与WB法等分子生物学有高度一致性，同时阐明了森登-4对OA的作用靶点。本方法为下一步的验证工作成为方法学提供参考，课题组将进一步进行相关蛋白通路的验证，为其进一步的药效物质基础分析和作用机制研究提供依据。