壮骨止痛胶囊调控自噬相关蛋白对去卵巢大鼠骨髓间充质干细胞增殖与骨向分化的影响

陈沙 李荣慧 吴结枝 曹宝丹 田国力 刘平安 张国民

湖南中医药大学，湖南 长沙 410208

绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis，PMOP)属于原发性骨质疏松症(primary osteoporosis，POP)中的I型[1]，PMOP其病位在骨，以疼痛为主要症状，可归类为中医的骨痹范畴[2]。根据国家统计局调查显示[3]，我国65岁以上人口约为1.4亿，是世界上老年人口绝对数最多的国家。预计到2050年，中国大陆骨质疏松性骨折发生率将达599万例/年，相应的医疗费用高达约254亿美元[4]，骨质疏松症将成为我国重要的公共健康问题之一。自噬是近年研究的热点，属于真核细胞的一种“自食”现象，是细胞特有的自我保护机制[5]。有学者[6]将细胞自噬与中医气虚时“精化气”的功能对比，气虚时，精可化气，以维持内环境阴阳平衡。认为细胞自噬与机体转化、消除内生痰浊瘀血实邪的功能息息相关，一旦调节失衡则可导致PMOP等疾病。目前，壮骨止痛胶囊对骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs)的作用机制尚未明确。本研究以去卵巢大鼠为研究对象，探索壮骨止痛胶囊调控自噬相关蛋白Beclin1、p62及LC3对去卵巢大鼠BMMSCs增殖与骨向分化的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1实验动物：选取SPF级SD雌性大鼠42只，体质量190～250 g，6～8周龄，于湖南中医药大学动物实验中心饲养[批号：SCXK(湘)2016-0002]，适应性喂养一周后进行试验[7]。

1.1.2试剂：壮骨止痛胶囊由补骨脂、淫羊藿、川牛膝、枸杞子、狗脊、女贞子、骨碎补等组成(四川美大康有限公司提供，批号181006，7味药按3∶3∶2∶2∶2∶2∶2比例配伍)；RAPA(MCE公司，批号38921)；3-MA(MCE公司，批号40214)；低糖DMEM基础培养(Gibco公司，批号8118374)；FBS胎牛血清(Gibco公司，批号42A0071K)；双抗(Gibco公司，批号1999384)；Trypsin-EDTA(Gibco公司，批号1868583)；CKK8试剂盒(上海七海复泰生物科技有限公司，批号20190124)；兔抗大鼠LC3抗体(MBL公司，批号034)；兔抗大鼠Beclin-1抗体(Proteintech公司，批号00065068)；兔抗大鼠p62抗体(Proteintech公司，批号00079494)；PPAR-γ试剂盒(上海JINGTIAN公司，批号20190729)；碱性磷酸酶试剂盒(南京建成生物有限公司，批号20190724)等。

1.2 方法

1.2.1分组及给药：将实验动物分为模型组、壮骨止痛胶囊组、雷帕霉素(RAPA)组、3-甲基腺嘌呤(3-MA)组、空白组及假手术组。模型组采用国内外公认的去除雌性大鼠双侧卵巢方法建立绝经后骨质疏松症病理模型[8-10]，假手术组摘除卵巢周围等质量脂肪组织，术后注射青霉素。空白组不做任何处理。术后6 d对壮骨止痛胶囊组、雷帕霉素(RAPA)组、3-甲基腺嘌呤(3-MA)组灌胃给药。壮骨止痛胶囊0.45 g/粒，成人剂量12粒/d，按人-大鼠体表面积折算确定大鼠壮骨止痛胶囊高浓度为1.944 g/(kg·d)，RAPA、3-MA溶解在油水比例为4∶6的玉米油中，RAPA浓度为6 mg/kg，3-MA浓度为8 mg/kg，连续给药12周。

1.2.2HE染色：给药周期结束后，断颈处死各组大鼠，取左侧后肢用于骨组织HE染色，检测股骨病理形态学变化。

1.2.3CKK8法检测各组BMMSCs的生长曲线及ALP活力：运用全骨髓贴壁法分离原代BMMSCs并培养至P2代，将P2代细胞胰酶消化以后，按2×103个/孔，每孔100 μL接种到96孔板，依次加入空白组、假手术组、模型组、壮骨止痛胶囊组、RAPA组和3-MA组细胞悬液，5个复孔。各孔中加入CKK8溶液，4 h后在450 nm波长处进行OD值测定，绘制BMMSCs的生长曲线[7]。按照微孔板法ALP试剂盒说明书测定ALP活力：将P2代BMMSCs悬液浓度配制为1×105个/mL，将1 mL细胞接种在24孔板中进行无菌培养，第3天换液，第7天弃掉上层完培，用PBS溶液清洗3次，最后一次清洗完成后在24孔板中依次加入1% Triton X-100 100 μL，冰上裂解30 min。收集裂解液，进行ALP活力的测定。

1.2.4免疫组化分析股骨中Beclin1、LC3及p62蛋白的表达：将修整好的左侧股骨蜡块取出，经脱蜡，水化，灭活，冷修复，滴加一抗(比例1∶100，4 ℃过夜)，清洗(洗液为PBS，3次，3 min/次)，滴加反应增强液(37 ℃，40 min)，清洗，滴加二抗(37 ℃，40 min)，清洗，DAB显色，流水冲洗，复染，烘干(60 ℃，3 min)，放置过夜，封片观察。阳性反应区域为棕黄色，北航MIAS图像分析Beclin1、LC3及p62蛋白的平均灰度值进行比较分析。

1.2.5ELISA检测血清PPAR-γ表达：末次灌胃给药后第二天取材，做好动物取材前期准备工作。大鼠麻醉固定，腹主动脉取血。按照双抗体夹心技术对大鼠血清PPAR-γ进行酶联免疫分析，使用多功能酶标仪检测450 nm波长的OD值，进行数据分析。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 股骨HE染色结果分析

空白组和假手术组骨膜完整，可见初级骨化中心与骨髓腔形成，许多初级骨髓腔融合成一个不断增大并加长的骨髓腔；模型组骨髓腔较小，细胞种类少，骨小梁稀少且窄，小梁间距加大，显示造模成功。壮骨止痛胶囊组和3-MA组，可见初级骨髓腔融合成一个不断增大并加长的骨髓腔，有骨发生现象，RAPA组骨髓腔中细胞数量增多。见图1。

图1 壮骨止痛胶囊自噬作用对股骨的影响(200×)Fig.1 Effect of Zhuanggu Zhitong Capsule on femur(200×)注：A:空白组;B:假手术组;C:模型组;D:壮骨止痛胶囊组;E:RAPA组;F:3-MA组。

2.2 大鼠P2代BMMSCs生长曲线的绘制

与空白组相比，假手术组BMMSCs生长曲线差异无统计学意义(P>0.05)；与模型组相比，壮骨止痛胶囊组、RAPA组和3-MA组细胞生长速率加快，有显著差异(P<0.01)；与RAPA组相比，壮骨止痛胶囊组和3-MA组细胞生长速率加快，有差异(P<0.05)，壮骨止痛胶囊组和3-MA组差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组大鼠BMMSCs生长速率OD值变化Table 1 Changes in OD value of BMMSCs growth rate of rats in each group

2.3 大鼠P2代BMMSCs ALP活力的测定

与空白组相比，假手术组BMMSCs的ALP活力差异无统计学意义(P>0.05)；与假手术组相比，模型组ALP活力降低，且有显著差异(P<0.01)，表明骨质疏松可使大鼠BMMSCs的ALP活力显著降低；与模型组相比，壮骨止痛胶囊组、RAPA组和3-MA组细胞ALP活力表达有显著差异(P<0.01)，均呈现增高趋势；与RAPA组相比，壮骨止痛胶囊组和3-MA组细胞ALP表达升高，结果有差异(P<0.05)，且壮骨止痛胶囊组和3-MA组细胞ALP表达差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

图2 各组大鼠P2代BMMSCs的ALP活力Fig.2 ALP activity of P2 generation BMMSCs of rats in each group注：与假手术组比较，△△P<0.01；与模型组比较，▲▲P<0.01；与RAPA组比较，*P<0.05。

2.4 大鼠股骨中Beclin1、LC3及p62蛋白的表达

与空白组比较，假手术组股骨Beclin1、LC3及p62蛋白平均灰度值表达差异无统计学意义(P>0.05)；与假手术组相比，模型组股骨Beclin1、LC3蛋白平均灰度值表达升高，p62蛋白平均灰度值表达降低，均有显著差异(P<0.01)；与模型组比较，壮骨止痛胶囊组和3-MA组Beclin1和LC3蛋白平均灰度值表达显著降低(P<0.01)，RAPA组表达显著升高(P<0.01)。壮骨止痛胶囊组和3-MA组p62蛋白平均灰度值表达显著升高(P<0.01)，RAPA组表达显著降低(P<0.01)；与RAPA组相比，壮骨止痛胶囊组和3-MA组Beclin1、LC3和p62蛋白表达均有显著差异(P<0.01)，且壮骨止痛胶囊组和3-MA组股骨Beclin1、LC3及p62蛋白平均灰度值表达差异无统计学意义(P>0.05)。见图3、4。

图3 各组大鼠股骨Beclin1、LC3及p62蛋阳性表达(免疫组化染色，400×)Fig.3 Positive expression of Beclin1, LC3 and p62 eggs in the femur of rats in each group (immunohistochemical staining, 400×)

图4 各组大鼠股骨Beclin1、LC3和p62蛋白平均灰度值表达Fig.4 The average gray value expression of Beclin1, LC3 and p62 protein in femur of rats in each group注：与假手术组比较，△△P<0.01；与模型组比较，▲▲P<0.01；与RAPA组比较，**P<0.01。

2.5 大鼠血清PPAR-γ检测

与空白组相比，假手术组血清PPAR-γ值表达差异无统计学意义(P>0.05)；与假手术组相比，模型组血清PPAR-γ值升高，且有显著差异(P<0.01)，表明去卵巢大鼠能升高血清中PPAR-γ值；与模型组相比，壮骨止痛胶囊组、RAPA组和3-MA组血清PPAR-γ值均显著降低(P<0.01)；与RAPA组相比，壮骨止痛胶囊组和3-MA组的血清PPAR-γ降低，有统计学意义(P<0.05)，且壮骨止痛胶囊组和3-MA组的PPAR-γ值表达无统计学意义(P>0.05)，结果见图5。

图5 各组大鼠血清PPAR-γ含量Fig.5 Serum PPAR-γ content of rats in each group注：与假手术组比较，△△P<0.01；与模型组比较，▲▲P<0.01；与RAPA组比较，*P<0.05。

3 讨论

原发性骨质疏松症以肾精亏虚、骨枯髓减为本，以瘀血痹阻、骨络失荣为标[11]。壮骨止痛胶囊具有补益肝肾、壮骨止痛之效，成为临床治疗骨质疏松症的良药。本方中君药补骨脂有温肾壮阳之功，臣药淫羊藿有强筋壮骨之效，此两味药能助生肝肾之阳。与之相辅的枸杞子、女贞子则能滋补肝肾之阴，方中骨碎补有活血通经之用，使全方补而不滞，牛膝则为引经药，引药下行达病所[12]。现代研究[13]表明，自噬是机体防御机制的重要组成部分，在由雌激素缺乏引发的骨质疏松中，其自噬水平产生变化，进而对BMMSCs的功能和活性产生一定的影响，进而参与骨质疏松症的发生、发展过程[14]。

通常WB、IHC、IF等方法检测出的LC3的量可作为直接或者间接判定自噬是否激活的标志[15]。RAPA是与自噬激活相关的一种物质，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是一种在进化上相对保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(serine/threonine protein kinase)，它有2种复合物形式，其中mTORC1对RAPA敏感。在RAPA刺激下或营养不足时，mTORC1会与失调51样激酶(uncoordinated-51-like-kinases，ULK)的复合物发生分离，促进ULK1/ULK2/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Atg13发生去磷酸化，介导自噬前体的形成、成核及延伸过程，即诱导自噬[16]。此外，Beclin 1、PI3KⅢ、3-MA 和p62蛋白对自噬也有影响。PI3KⅢ能与Beclin 1结合，形成Beclin 1-PI3KⅢ这种复合体，介导自噬前体和自噬体膜的形成，提高细胞的自噬水平。因此，Beclin 1和PI3KⅢ可以看做自噬的正向调控因子，3-MA则是通过抑制PI3KⅢ的活性抑制自噬[17-20]。p62蛋白是与自噬水平呈负相关的蛋白分子。当自噬激活时，p62蛋白与PE结合，定位于胞质中，并与LC3-Ⅱ结合形成复合物被自噬溶酶体降解[21]，导致p62蛋白会在胞质中被不停地降解，表达随着下降。

BMMSCs是一种具有多向分化能力的干细胞，成脂或者成骨分化受到多种因素调控。前期研究发现[22-24]，壮骨止痛胶囊能调控Wnt/β-catenin和NF-κB信号通路，上调Wnt3a、β-catenin、LRP5蛋白的表达，下调GSK3β、NF-κB p65和IκBα蛋白表达，促进成骨，改善骨密度。壮骨止痛胶囊促成骨作用中涉及到的Wnt信号通路和Runx 2等转录因子的表达与BMMSCs有一定的关联。研究认为[25-27]Wnt信号通路除了对成骨细胞有一定的调节作用外，其对BMMSCs分化方向的选择具有决定性作用，BMMSCs既能成骨分化，也能成脂分化，且存在一定的动态性、连续性和阶段性。Wnt信号通路激活后，在伴有Runx 2等成骨相关转录因子高表达的情况下，能极大地促进成骨前体细胞及干细胞的骨向分化。此外，Wnt信号通路对成脂相关蛋白PPAR-γ也存在负向调控作用，且能显性抑制成脂分化过程中细胞内的生物学变化，从而抗成脂分化[28-29]，一般认为，PPAR-γ的高表达能正向调控脂肪分化的早期阶段[30]。这个结论与本研究血清PPAR-γ的表达较一致，分析各组大鼠血清中的PPAR-γ水平发现，壮骨止痛胶囊组和3-MA组的PPAR-γ水平表达降低，具有同步性。

ALP活力[31-35]是成骨细胞中期和晚期分化的标志，对BMMSCs的作用意味着其成骨化趋势。在原代培养出的BMMSCs中，壮骨止痛胶囊组与3-MA组的BMMSCs的增殖和ALP活力变化具有趋同性，表明壮骨止痛胶囊组与3-MA组的实验结果有较大相关性。研究表明[36-37]细胞自噬在BMMSCs的成脂分化过程中起到关键作用，但尚未有明确结论。本研究中，壮骨止痛胶囊组自噬相关蛋白Beclin 1、LC3和p62蛋白的表达与模型组呈现显著差异，且壮骨止痛胶囊的作用与自噬抑制剂3-MA类似，可以推测壮骨止痛胶囊通过负向调控自噬相关蛋白Beclin1、p62、及LC3，抑制BMMSCs脂向分化，从而促进成骨。

综上，壮骨止痛胶囊能降低血清中脂向表达分子PPAR-γ的表达，下调去卵巢大鼠股骨中自噬相关蛋白Beclin1和LC3的表达，上调p62的表达，增加其BMMSCs细胞增殖活力和ALP活力，促进成骨。