金匮肾气丸防治骨质疏松症的机制研究

李伟杰 梁润英

河南中医药大学，河南 郑州 450046

骨质疏松症(osteoporosis，OP)以骨量降低、骨组织微结构损坏，致骨脆性增加，易发生骨折为特征的常见全身性骨骼疾病，典型临床表现为疼痛、脆性骨折、脊柱变形等[1]；并且OP与年龄及性别关系密切[2]。当前OP的主要治疗药物有骨吸收抑制剂、骨形成促成剂和其他机制类药物，如长期使用则会有一定不良反应；某些临床基础病的OP患者，使用这些药物时也有一定限制[3]。中医药防治OP逐渐被普通民众和患者认可，引起国内外学者广泛关注[4-5]。据OP临床表现将其归于中医“骨痿”“骨痹”“骨枯”范畴，主要病机为肾精亏虚，髓海空虚，骨失濡养[6]。

金匮肾气丸(Jinkui Shenqi Pills，JSP)出自汉·张仲景《金匮要略》，由熟干地黄、山药、山茱萸、桂枝、附子、泽泻、茯苓、牡丹皮组成，可补肾固本，填精益髓，肾之精气旺，则骨髓得充、筋肉得养。但目前对该方防治OP作用机制的研究较少，故本研究以探索“药物-疾病”之间的关系为本，从宏观至微观层面挖掘JSP防治OP的主要成分、关键靶标基因和信号通路等，系统探讨其作用机制，揭示中医药复方“多成分-多途径-多靶点”的作用机理，为JSP防治OP的机制研究与实验验证提供参考依据，也为治疗OP提供理论支撑，从而推动经方的现代化研究进程。

1 资料与方法

1.1 JSP活性成分及潜在作用靶标收集

从中药系统药理学分析平台(TCMSP，http//tcmspw.com/tcmsp.php)检索JSP中熟地、山药、山茱萸、桂枝、附子、泽泻、茯苓、牡丹皮的活性成分；以口服生物利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.18筛选活性成分。将筛选得到的各中药活性成分所对应的靶标蛋白名输入STRING(https://string-db.org)数据库，映射出标准基因名。建立JSP“药物-活性成分-靶标基因(Herb-Ingredient-Target，H-I-T)”数据集，用Cytoscape3.6构建“H-I-T”网络图，用Network Analyzer插件进行网络拓扑学分析，以Degree≥50为标准评价药效和靶标重要性，获取和分析关键活性成分。

1.2 OP疾病基因、与JSP药靶交集基因信息收集

以“Osteoporosis”为关键词在DisGeNET(http://www.disgenet.org/)和GeneCards(https://www. genecards.org/)中查询疾病基因后去重、整合，建立疾病基因数据集。取JSP活性成分靶标和OP疾病基因交集，制作韦恩图，探究JSP活性成分对OP靶标的靶向作用。

1.3 JSP-OP交集靶标PPI网络构建与关键基因筛选

将JSP-OP共同靶标基因输入STRING，设置“Homo sapiens”为物种，“high confidence(0.700)”为最低相互作用阈值，隐藏网络中无关联节点，得到蛋白质相互作用(PPI)网络文本信息后输入Cytoscape3.6，获取可视化PPI网络图；关键基因在相关通路中会影响其他基因调控，用CytoHubba 插件[7]对PPI网络进行拓扑结构分析，MCC值越高节点在网络中越重要；Degree值越大越可靠，故以二者为参考，识别和筛选关键基因。

1.4 关键基因GO、KEGG通路富集分析

将关键基因输入David(https：//david.ncifcrf.gov/)数据库，富集分析GO生物功能与KEGG通路，以P≤0.05表示结果显著性，P值越小越显著。按P值由小到大排序，将GO生物功能中富集度高的前10名生物途径(BP)、分子功能(MF)和细胞组分(CC)及前30名 KEGG通过Omicshare工具( http://www.omicshare．com/tools/)用高级气泡图形式展现，再通过京都基因与基因组百科全书(https://www.kegg.jp/)描述通路，找出重要通路并标记关键基因。

2 结果

2.1 JSP“药物-活性成分-靶标基因”数据收集结果与H-I-T网络图

2.1.1金匮肾气丸“药物-活性成分-靶标基因”数据：筛选后删除重复项并剔除未匹配到靶标者，符合OB≥30%、DL≥0.18并可进一步研究的活性成分有47个，详见图1和表1。经STRIN映射删除重复项及非人体作用后的活性成分蛋白靶标，得到药靶基因196个。

图1 活性成分及对应靶标基因数据Fig.1 Data of active ingredients and corresponding target genes

表1 47种重要活性成分及对应靶标数Table 1 Data of 47 active ingredients and corresponding targets

2.1.2金匮肾气丸“H-I-T”网络图：图2为“H-I-T”网络图，该网络有251个节点和1 212条边，图中黄色菱形节点为JSP中药物，红色“V”形节点为药物活性成分，绿色圆形节点为药物活性成分的靶标基因。经网络拓扑学分析，Degree≥50的活性成分有：槲皮素(Quercetin，145)、豆甾淳(Stigmasterol，81)、β-谷甾醇(Beta-sitosterol，62)、山柰酚(Kaempferol，57)，可能为JSP防治OP的主要活性成分。图3为“H-I-T”部分聚集网络，更清晰地展示了中药、活性成分、靶标基因间通过“边”相连，它们之间相互作用，体现了JSP发挥治疗作用时“多成分-多靶点”的特点。

图2 中药-活性成分-靶标网络(H-I-T network)Fig.2 Herb-ingredient-target network

图3 中药-活性成分-靶标部分聚集网络Fig.3 Herb-ingredient-target partial aggregation network

2.2 OP疾病基因及与JSP药靶基因的交集基因信息

将在DisGeNET和GeneCards 检索到的OP疾病基因去重后归一整合，得到4 416个疾病基因。取疾病基因与196个JSP药靶基因的交集，获得145个JSP防治OP的潜在可能靶标基因，Venn图见图4。

图4 JSP-OP药物靶标基因与疾病基因Venn图Fig.4 Venn diagram of JSP-OP

2.3 关键基因筛选结果及JSP-OP交集和关键靶标基因PPI网络

取MCC值前50的基因，按Degree值由大到小排序，排名前30的基因即为关键基因，详见表2。构建JSP-OP交集和关键靶标基因PPI网络图，见图5。隐藏无关联节点后有8个基因未参与网络构建，故该网络有137个节点，1 116条边。图5中八边形节点为107个非关键基因，菱形节点为30个关键基因，节点越大说明其MCC和Degree值越高，在网络中作用越显著。图与表结合，推测AKT1、TP53、IL6、MAPK1、MAPK8、JUN可能为JSP防治OP的核心靶标。

表2 30个关键基因信息数据Table 2 Information of 30 key genes

图5 JSP-OP交集和关键靶标基因PPI网络图Fig.5 PPI network of JSP-OP target genes

2.4 关键基因 GO生物功能和KEGG通路富集分析结果

2.4.1GO生物功能富集分析结果：结合GO富集结果及气泡图，可得JSP-OP关键基因主要参与的生物途径有药物反应、转录正调控和DNA模板化、RNA聚合酶Ⅱ启动子的转录正调控；分子功能主要有酶、相同蛋白以及蛋白等的结合；关键基因主要调控核浆、胞浆、细胞核等细胞组分，详见图6。

图6 GO生物功能富集分析Fig.6 GO biological enrichment analysis

2.4.2KEGG通路富集分析结果：通路富集后共得到85条相关信号通路，筛选后排名前30的通路详细信息气泡图见图7。根据气泡大小及表现，忽略与“cancer”及其他明确疾病直接相关的通路，JSP-OP交集和关键基因所涉及的重要通路有：TNF、MAPK、PI3K-Akt等，通路详图见图8～10。以红色和绿色分别标记JSP-OP交集关键基因与非关键基因可能作用的潜在靶标。

图7 KEGG通路富集分析Fig.7 KEGG pathways of the intersecting target genes

图8 TNF 信号通路Fig.8 TNF signaling pathway

3 讨论

《素问·六节藏象论》言“肾者……其充在骨”，《灵枢·经脉篇》又言：“足少阴气绝，则骨枯”，而OP的中医病因病机总以肾之虚损为主，故当补肾固本、填精益髓；临床实践表明，金匮肾气丸可使肾之精气旺，骨髓得充、筋肉得养，对OP有很好的防治效果。槲皮素和山萘酚主要来自JSP中的牡丹皮，牡丹皮有活血散瘀之功，又能通利经脉，可促使肾中精气的蒸腾气化；研究表明槲皮素能促进成骨细胞分化活性，抑制破骨细胞骨吸收、诱导破骨细胞凋亡，促进骨髓间充质干细胞的增殖和骨向分化，并通过上调BMP2和Smad4 的表达改善骨质疏松症[8-9]；高剂量山萘酚可调节体内Ca2+的代谢平衡，促进骨胶原生成并减少骨小梁丢失，故对OP有治疗作用[10]。β-谷甾醇和豆甾醇均属植物甾醇类，主要存在熟地黄、山药、山茱萸、桂枝中，JSP方以熟地为君，“填骨髓，长肌肉”，滋阴血补肾精；山药健脾固肾，助地黄生肾精之功，山茱萸补益肝肾，两药合用，滋养肾精，亦可促使肾精发挥正常生理作用；桂枝温通经脉，辅地黄、山茱萸、山药以阳中求阴，使肾中精气充盛，机体气化归于正常；β-谷甾醇能促进成骨作用、有效抑制破骨作用达到护骨的目的，且能作用于卵巢颗粒细胞(骨细胞外的另一靶部位)，促使其产生分别与成骨及破骨细胞膜上雌激素受体结合的E2，协同调节骨代谢平衡[11]。

图9 MAPK 信号通路Fig.9 MAPK signaling pathway

图10 PI3K-Akt 信号通路Fig.10 PI3K-Akt signaling pathway

NCOA2表达在多种激素反应组织上，参与生殖发育、骨形态发生、癌症及其他病理情况[12]。PTGS2又称COX-2，与细胞炎症反应密切相关，中性粒细胞调节炎症的机制之一是COX-2的分泌，下调COX-2能减轻炎症反应[13]。骨形成与骨破坏失衡是OP发病的重要原因，JSP中槲皮素、豆甾淳、β-谷甾醇、山柰酚等重要活性成分通过整体调控激素水平、抗氧化、免疫调节等抑制骨吸收和促进骨生成方面，促进成骨细胞与破骨细胞平衡；炎症和破骨细胞的相互作用导致OP[14]，以上重要活性成分均有抗炎作用，而PTGS2也可能是JSP防治OP的重要一环。综上，JSP中槲皮素、豆甾淳、β-谷甾醇、山柰酚等主要药物活性及其对应的较为显著的靶标基因NCOA2、PTGS2之间相互影响、相互作用，可能为防治OP的关键。

PPI网络分析和关键基因筛选结果表明，JSP作用于OP的关键靶标基因为AKT1、TP53、IL6、MAPK1、MAPK8、JUN。AKT家族基因与骨骼肌肉的发育密切相关，可调控细胞生存、增殖、代谢、凋亡[15]，敲除大鼠AKT1与AKT2基因，其骨骼、肌肉表现为发育不全[16-17]，考虑破骨细胞活性大于成骨细胞。目前未见TP53与OP发生机制的研究，但可明确：药物干预能激活相应靶标基因，引导成骨细胞增殖分化及破骨细胞凋亡，提示JSP中相关活性成分通过TP53诱导成骨或破骨细胞生物学过程对OP产生影响。IL6是调节骨吸收的促炎细胞因子，其水平增加可刺激破骨细胞形成并诱导其活性增强，致骨代谢失衡性骨质疏松，拮抗或敲除IL6可阻止骨小梁中破骨细胞增加[18-19]。MAPK1和MAPK8均属MAPK激酶家族，参与细胞生长及分化调节，能诱导血管内皮细胞形成、促进成骨细胞增殖与分化，调节骨形成[20]；JUN为快速反应基因，与靶基因上调节区AP-1位点结合促进成骨细胞增殖与分化，并在其相关基因表达中发挥重要作用[21]。OP与成骨细胞产生率和破骨细胞凋亡率密不可分，调控关键靶标基因可使二者处于平衡状态，即通过调节骨代谢防治OP[22]。

GO富集分析结果表明JSP发挥效应的细胞场所与其生物功能过程相一致：在胞外及蛋白质复合物上进行蛋白质结合代谢、调控及酶结合，进而参与到包括氧化、药物、氨基酸等应激反应在内的复杂生物过程；在细胞核区参与转录因子、DNA及RNA特异性结合，调控细胞生长、增殖、凋亡等细胞周期过程。上述JSP-OP关键基因调控成骨与破骨细胞所涉及的细胞增殖分化、信号转导及受体结合等文献报道，与本研究GO富集结果一致。

通路富集结果显示，TNF、MAPK、PI3K-Akt等信号通路富集大量关键基因；HIF-1、Toll样受体、雌激素、破骨细胞分化等信号通路富集较多关键基因；以上通路可能为JSP防治OP的关键通路。TNF信号通路主要传导炎性因子，炎性因子TNF-α参与绝经后OP的发生，抑制成骨细胞并促进破骨细胞分化，还可促进RANKL的表达，诱导破骨细胞形成[23-24]。MAPK信号通路通过调控细胞增殖分化发挥相应生物功能，在骨代谢平衡方面作用重要[25]。PI3K-Akt信号通路在细胞生物过程和骨代谢方面都很重要，PI3K-Akt途径的激活能刺激成骨细胞增殖和分化，并抑制其凋亡；还可影响破骨细胞形成及分化[26]；而PI3K-Akt与 MAPK信号通路可协同调控成骨及破骨细胞，影响二者增殖、分化与凋亡[27]。上调HIF-1信号通路可通过血管-成骨偶联促进骨和血管形成，增加破骨细胞的活性及数量，影响骨形成与吸收[28-29]。Toll样受体信号通路与MAPK及Akt通路协同作用，降低受体磷酸化水平及破骨细胞的骨吸收[30]；骨细胞上的Toll样受体4参与由TLR通路介导的下游NF-KB表达活化破骨细胞[31]。雌激素参与成骨与破骨细胞生物过程，维持二者动态平衡，并影响间充质干细胞向成骨方向增殖、分化[32]；还可通过免疫细胞分泌的成骨细胞与细胞因子间接抑制破骨细胞分化、增殖，降低其活性[33]，故该通路在调节骨代谢平衡方面作用重大。破骨细胞分化通路直接与OP相关，TNF、IL-1、雌激素等作用于该通路，影响破骨细胞生长和凋亡；且破骨细胞受体内、外因素和复杂信号通路共同调节；一旦平衡被打破，可致OP、股骨头坏死、骨硬化病等多种骨代谢疾病[34-35]。

不同疾病之间相互关联与影响，具有微妙的调控机制：类风湿性关节炎可使关节面软骨及软骨下骨因炎症因子及增生的滑膜组织而破坏，致破骨细胞活性增强、骨吸收进程加快[36-37]；非酒精性脂肪肝影响诸多代谢通路来调节骨密度[38]；2型糖尿病患者体内异常活化的炎症因子TNF-α、IL-1、IL-6等打破骨形成与吸收之间的代谢平衡，诱发OP[39]；据此可推测，JSP能通过类风湿性关节炎、非酒精性脂肪肝、糖尿病等疾病相关通路防治OP。

4 总结与思考

本研究依据数据库信息，发现金匮肾气丸中的槲皮素、豆甾淳、β-谷甾醇、山柰酚等核心活性成分通过TNF、MAPK、PI3K-Akt、HIF-1等信号通路干预AKT1、TP53、IL6、MAPK1、MAPK8、JUN等关键靶标表达，促进成骨细胞生成、抑制破骨细胞分化，维持骨代谢平衡，从而防治骨质疏松症。在理论层面为金匮肾气丸活性成分筛选、防治骨质疏松相关靶标及通路预测提供数据支撑，有助于揭示金匮肾气丸防治骨质疏松症的科学内涵。但并未将金匮肾气丸与骨质疏松症的相关证型做对应；临床应用上，金匮肾气丸各中药活性成分及其含量在炮制过程中可能会相互作用甚至发生变化。故拟开展动物实验、分子生物学、药理药效代谢学等更深入的探索性研究，验证并对应本研究结果，积极探索中医药与骨质疏松症防治的结合点。为更好地传承与发扬仲景学术思想及经方研究奠定基础，推动中医药现代化发展进程。