野生皱盖钟菌风味类氨基酸组成初探*

苗彩霞，史明泽，尹晓约，宋文浩，王一东

（长春理工大学生命科学技术学院，吉林 长春 130022）

钟菌（Verpa spp.）属于真菌门（Mycophyta）子囊菌亚门 （Ascomycotina） 盘菌纲 （Discomycetes）盘菌目（Pezozales） 羊肚菌科（Morchellaceae） 钟菌属（Verpa），属内有多个亚种，因其子实体横断面与钟罩相似而得名。其肉质脆、味鲜美，亲缘关系上与羊肚菌属（Morchella） 密切，外型也与羊肚菌类似，因此又被称为假羊肚菌或小羊肚菌。目前国内有云南、西藏、山西、吉林等地分布的报道[1-6]。

随着生活水平的提高，人们对营养、美味、健康食材的需求越来越大，而珍稀美味的食用菌越来越受到人们的青睐。食用菌的滋味和口感与其所含的非挥发性风味物质组成有很大关系，包括可溶性糖醇﹑呈味氨基酸、风味核苷酸、有机酸、呈味肽以及其他类呈味物质，其中以谷氨酸为代表的L构型天然氨基酸是食品中具有鲜香味道的主要贡献组分，呈味氨基酸的类型与含量是影响风味的主要因素之一[7-8]。目前氨基酸的分析方法主要有高效液相色谱法、气相色谱法等[7，9-15]。虽然钟菌是与以美味著称的羊肚菌亲缘关系很近的食用菌，但目前对其风味物质的组成了解较少。研究利用柱前衍生高效液相色谱法对钟菌样本的风味类氨基酸组成及含量进行了初步的检测，并与羊肚菌进行了比较，为认识了解和开发利用钟菌提供参考与借鉴。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器

1.1.1 试验材料

钟菌子实体样本，2016年5月采集于长春市净月潭国家森林公园，经孢子萌发、菌丝培养、测序及形态学鉴定，鉴定其为皱盖钟菌 [Verpa bohemica（Krombh.）J.Schröt.]，同时鉴定保存的还有普通羊肚菌样本[Morchella esculenta（L.）Pers.]。自然干燥后子实体样本保存于长春理工大学生命科学技术学院。

1.1.2 试验试剂

甲醇、乙腈均为色谱纯试剂，购于美国赛默飞世尔公司；18种氨基酸标准品，购于中国惠世生化试剂有限公司（上海）；异硫氰酸苯酯、甲酸、盐酸等其他试剂，均为国产分析纯试剂。

1.1.3 仪器与设备

安捷伦1260分析型高效液相色谱仪，德国安捷伦科技有限公司；JY92-IIN超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物科技股份有限公司；TGL-16C高速台式离心机，上海安亭科学仪器厂。

1.2 试验方法

1.2.1 样品处理

称取干燥后的钟菌子实体样本（菌盖、菌柄混合）200.0 mg，充分研磨后溶于4.0 mL的30%甲醇和0.1%甲酸水溶液，45℃超声破碎仪超声30 min破碎再混匀，12 000 r·min-110℃离心10 min，取上清液0.22 μm滤膜过滤，即得50.0 mg·mL-1的样品提取液，此提取液为钟菌待检样品。4℃保存待用[16]。

同样的方法处理得到羊肚菌待检样品。

1.2.2 氨基酸标准溶液的制备

精准称取天门冬氨酸（Asp） 1.43 mg、苏氨酸（Thr） 0.76 mg、 丝氨酸 （ser） 0.76 mg、 谷氨酸（Glu） 3.11 mg、甘氨酸 （Gly） 0.41 mg、丙氨酸（Ala）1.12 mg、缬氨酸（Val）0.81 mg、半胱氨酸（Cys）0.17 mg、蛋氨酸（Met）0.16 mg、异亮氨酸（Ile） 0.69 mg、亮氨酸 （Leu） 0.60 mg、酪氨酸（Tyr）0.41 mg、苯丙氨酸（Phe）0.61 mg、赖氨酸（Lys） 0.31 mg、组氨酸 （His） 0.21 mg、精氨酸（Arg） 0.67 mg、脯氨酸 （Pro） 0.56 mg、色氨酸（Trp） 0.15 mg，分别放入100 mL容量瓶中，各加入100 mL 0.1 mol·L-1的盐酸定容，此为氨基酸标准品溶液。4℃保存待用。

1.2.3 色谱条件

参考黄元河[12]、王敏[13]的方法，采用InertSustain-C18色谱柱 （250 mm×1.6 mm，5 μm），进样体积为 20 μL；流速为 0.80 mL·min-1；柱温 40℃。

以 0.1 mol·L-1乙酸钠缓冲液-乙腈 （93∶7，pH 6.5） 为流动相 A，甲醇-乙腈-水 （1∶3∶1） 为流动相B，参照洗脱梯度见表1[12]，为求得最优的样本分离效果，进行随时间改变的A/B相浓度梯度洗脱条件比较。

表1 流动相洗脱程序Tab.1 Mobile phase elution procedure

1.2.4 衍生化试剂的制备与样品的衍生化处理

衍生试剂A（1 mol·L-1三乙胺乙腈溶液）：量取1.4 mL三乙胺于试剂瓶中，加入8.6 mL乙腈，混匀，4℃保存；

衍生试剂B（0.1 mol·L-1异硫氰酸苯酯乙腈溶液）：量取0.12 mL异硫氰酸苯酯于试剂瓶中，加入9.88 mL乙腈，混匀，4℃保存。

参考唐翎等[9，12]试验方法，分别取1.2.1中钟菌、羊肚菌样品提取液400 μL，衍生试剂A、衍生试剂B各200 μL于2.5 mL离心管中避光，反应1 h后加入 800 μL 正己烷振荡 5 min，12 000 r·min-1，10℃离心5 min，取下层液约0.5 mL用0.22 μm滤膜过滤，即得衍生样液。选择异硫氰酸苯酯柱前衍生法[9]与样品无衍生处理进行分离效果比较。

各氨基酸标准溶液以及空白样品（30%甲醇和0.1%甲酸水溶液）衍生化处理同上。

1.2.5 数据收集与分析

样品重复检测3次，数据分析采用Excel软件完成。氨基酸味道强度值（Taste active value，TAV）的计算方法参考文献[7，17-18]。 味道强度值（TAV） 是用来评价样品中某一呈味成分（本研究中为氨基酸）对样品鲜味强度的影响程度的数值。计算公式为：

式中：C为样品中所含该种氨基酸浓度（mg·g-1）；T为该种氨基酸的味觉阈值。

当TAV>1时，该种呈味物质对于样品的呈味有显著影响，数值越大则贡献越大；当TAV<1时，表明该呈味物质对呈味贡献不大，呈味作用不显著[7，18]。

2 结果与分析

2.1 色谱条件流动相的影响

参照的流动相分离钟菌样品在4 min～15 min出锋，分离效果不理想。在此基础上尝试了2种洗脱梯度，甲法：

图1 洗脱梯度甲（A）、洗脱梯度乙（B）、空白对照（C） 液相色谱图Fig.1 Liquid chromatograms of elution gradient(A),elution gradient(B)and blank control(C)

4 min～11 min，95%～80%流动相A，5%～20%流动相B；乙法：0～11 min，100%～95%流动相A，0～5%流动相B。得到的分离效果见图1。

图1所示，流动相梯度乙方法较甲方法出锋状况有所改善，分离效果优于甲方法，因此采用乙方法进行流动相梯度洗脱。

2.2 柱前衍生的效果

皱盖钟菌衍生效果变化情况见图2。

图2 皱盖钟菌衍生前（A）、钟菌衍生后（B） 液相色谱图Fig.2 Liquid chromatograms of Verpa bohemica before(A)and after(B)derivatization

由图2所示，样品提取液直接加样得到的色谱图峰（A），约4 min时色谱峰集中，且在10 min、29 min、35 min处色谱峰识别效果较差；选择异硫氰酸苯酯柱前衍生法处理样品，得到的样本氨基酸较之前具有良好的出峰分离和识别效果（B）。

2.3 氨基酸标准品检测结果

采用上述流动相洗脱梯度乙方法及样品柱前衍生方法，对氨基酸标准品进行测定，其线性关系统计见表2。

表2 18种氨基酸的线性关系Tab.2 Linear relationships of 18 amino acids

由表2所示，上述氨基酸在相应的浓度范围内线性关系良好。

2.4 样品测定结果

对皱盖钟菌中的风味类氨基酸组成进行测定，标准品图谱峰号1～18分别为天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、赖氨酸；得到的样本（A）、标准品（B） 及空白对照（C，30%甲醇和0.1%甲酸水溶液的衍生化溶液） 液相色谱图分析结果见图3。

图3 皱盖钟菌样品（A）、18种氨基酸混合标准品（B）和空白对照（C）液相色谱图Fig.3 Liquid chromatograms of Verpa bohemica sample(A),18 Amino acids mixed standard(B)and blank control(C)

由图3可知，在皱盖钟菌中共检测到18种氨基酸，其中呈味氨基酸有15种，包括天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸等。

采用与钟菌相同的处理方法对羊肚菌中风味类氨基酸进行检测，二者色谱图的对比情况见图4。

图4 羊肚菌（A）、皱盖钟菌（B） 液相色谱图Fig.4 Liquid chromatograms of Morchella esculenta(A)and Verpa bohemica(B)

由图4可知，羊肚菌（A） 与皱盖钟菌（B） 有着近似的图谱，说明其含有相同的氨基酸种类；图谱中峰高有区别，说明部分氨基酸的含量（浓度）不同，呈味氨基酸含量（浓度）的不同使得二者的风味有区别。

结合表2线性方程得到钟菌、羊肚菌样品氨基酸含量值，根据TAV计算公式计算得对应的呈味氨基酸TAV，结果见表3。

表3 皱盖钟菌和羊肚菌呈味氨基酸组成及TAVTab.3 Amino acid composition and teste active value of Verpa bohemica and Morchella esculenta

由表3可知，羊肚菌中TAV>1的有：天门冬氨酸（5.440）、谷氨酸（4.550）、甘氨酸（2.012）、组氨酸（4.420）、精氨酸（4.040）、苏氨酸 （1.019）、甲硫氨酸（1.053），对鲜、酸、甜、苦味均有较大贡献，羊肚菌鲜美的味道与这些氨基酸的重要贡献有关；皱盖钟菌TAV>1的有：天门冬氨酸（5.178）、谷氨酸（4.397）、甘氨酸（1.223）、组氨酸（6.230）、精氨酸（6.328）、苏氨酸（1.022）、缬氨酸（1.065）、甲硫氨酸（13.910），对鲜、酸、甜、苦味亦均有较大贡献。且皱盖钟菌与羊肚菌对应的氨基酸TAV接近，说明其具有与羊肚菌的味道鲜美的相似氨基酸组成。对于呈味氨基酸总量和必需氨基酸含量，皱盖钟菌均多于羊肚菌。

3 讨论

从检测结果可以看出，野生皱盖钟菌子实体中含有天门冬氨酸、谷氨酸等15种风味类氨基酸，其中氨基酸TAV大于味觉阈值的有天门冬氨酸、谷氨酸等8种氨基酸，对鲜、酸、甜、苦味均有较大贡献，构成了钟菌独特的风味。

对比羊肚菌的检测结果可以看出，野生皱盖钟菌子实体中风味类氨基酸种类与羊肚菌相似，都含有组氨酸、精氨酸等15种风味类氨基酸，但二者风味类氨基酸含量对呈味的贡献有差异，且皱盖钟菌的呈味氨基酸总量大于羊肚菌，这也验证了民间小羊肚菌（钟菌）比羊肚菌味道鲜美的说法。从试验结果中可以看出，皱盖钟菌与羊肚菌均含有人体必需的8种氨基酸，且皱盖钟菌的必需氨基酸含量大于羊肚菌。说明检测样本野生钟菌风味与营养价值不逊于野生羊肚菌。

目前羊肚菌的栽培面积在逐年扩大，但人们对羊肚菌的生活史还未完全了解，羊肚菌的人工栽培还存在着较大的技术风险。钟菌和羊肚菌的亲缘关系很近，可否可通过对钟菌的深入了解，尤其是对其生活史的研究，为人们认识羊肚菌的生活史提供参考和帮助。此外，研究发现，羊肚菌有多种保健作用，如抗疲劳功能等[19-20]，钟菌作为羊肚菌的近亲，对其开展包括风味物质在内的食（药）用价值、功能活性等的深入研究，可为开发利用这一珍稀食用菌资源提供帮助。研究仅对皱盖钟菌与普通羊肚菌进行了比较试验，其他种类钟菌的风味氨基酸检测分析还有待进一步的研究验证。