羊肚菌母种培养基及培养条件优化研究*

赵航轲，陈 杭，马 薇，羊玉蓉，降初拉尔布，唐 瑶，刘良珍，唐明先

（甘孜州农业科学研究所，四川 康定 626000）

羊肚菌（Morchella spp.）隶属于子囊菌亚门（Ascomycota） 盘菌纲 （Discomycetes） 盘菌目 （Pezizales） 羊肚菌科 （Morchellaceae） 羊肚菌属（Morchella）[1-3]，是世界四大珍贵食用菌之一。富含19种氨基酸，其中9种为人体必需氨基酸，约占氨基酸总含量的40%[4]，同时含有39.7%的碳水化合物及24.5%的蛋白质，具有较高的营养价值[5]。此外，研究发现羊肚菌多糖和蛋白质[6]具有抗肿瘤、免疫调节、抗氧化和降低胆固醇等药用活性[7-9]，对抗肿瘤药物的研究与开发具有重要意义[10-11]。

羊肚菌母种退化是导致其栽培时抗逆性差、产量低、品质差的重要原因。2018年～2020年，甘孜州羊肚菌栽培面积迅速扩大到2 000 hm2，获得巨大经济效益，在扶贫攻坚中发挥较大作用。近年来甘孜州部分农户采用自己制备的羊肚菌菌种，不仅因为技术和经验不足，同时更因母种自带杂菌，且营养条件和培养条件不适合菌丝生长和保存，出现了种源混乱、抗逆性差、新型病虫害增多、品质参差不齐、产量差异明显等问题，给菇农造成了巨大损失。若要羊肚菌产业健康发展，必须保障优良的母种。因此，对羊肚菌母种的营养及环境条件进行系统优化，为羊肚菌母种的复壮、保藏提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

六妹羊肚菌（Morchella sextelata M.Kuo） 菌株，由甘孜藏族州农业科学研究所提供。

1.1.2 培养基

基础培养基：葡萄糖20 g、酵母粉5 g、KH2PO41 g、VB110 mg，蒸馏水1 000 mL，pH自然。

1.2 方法

1.2.1 菌种活化

将保藏的羊肚菌菌种接种于固体培养基上，置于24℃恒温培养箱培养7 d。

1.2.2 羊肚菌液体种培养基组分的优化

1） 碳源筛选

自活化菌株取0.5 cm×0.5 cm的菌块分别接种至玉米粉、可溶性淀粉、玉米芯粉、蔗糖、麦芽糖、果糖、乳糖、甘露醇替代葡萄糖的基础培养基中，各组分含量保持不变，播床24℃、160 r·m-1避光恒温培养，每12小时测量菌丝生长速度，共培养1周后确定最佳碳源，筛选出最适浓度。

2） 氮源筛选

自活化菌株取0.5 cm×0.5 cm的菌块分别接种至蛋白胨、黄豆粉、硫酸铵、硝酸钾、硝酸钠、硝酸铵、尿素、硝酸钙替代酵母粉的基础培养基中，其余培养方法同碳源筛选。

3） 无机盐筛选

自活化菌株取0.5 cm×0.5 cm的菌块分别接种 至 FeSO4、 CaCl2、 NaCl、 K2PO4、 MgSO4·7H2O、MnSO4、K2SO4替代K2HPO4的基础培养基中，其余方法同氮源筛选。

4） 生长因子筛选

自活化菌株取0.5 cm×0.5 cm的菌块分别接种至VB2、VB6、VB7、吲哚乙酸、叶酸、烟酸、赤霉素替代VB1的基础培养基中，其余方法同无机盐源筛选。

正交法优化母种培养基组分：在单因素试验基础上，以最佳碳源、最佳氮源、最佳无机盐、最佳生长因子作为4个影响羊肚菌母种培养基组分的因素，正交试验方案见表1。

表1 母种培养基组分的正交优化试验Tab.1 Orthogonal optimization experiment on thecompositions of medium for stock culture

1.2.3 羊肚菌液体菌种培养条件的优化

在最佳培养基基础上选取透光率为0、20%、40%、60%、80%、100%，使用1%盐酸和1%的氢氧化钠溶液调节初始pH为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，培养温度为 18℃、20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃，在单因素试验基础上采用三因素三水平正交试验筛选出羊肚菌母种最佳培养条件。正交试验方案见表2。

表2 母种环境条件的正交优化试验Tab.2 Orthogonal optimization experiment of cultivation conditions for stock calture

2 结果与分析

2.1 母种培养基组分优化结果

2.1.1 母种培养基组分单因素试验结果

最佳碳源及最佳浓度的筛选结果见图1。

图1 最佳碳源（A） 及最佳浓度（B） 筛选Fig.1 Screening of optimal carbon source(A)and optimal concentration(B)

如图1所示，8种碳源均能促进菌丝生长，其中以可溶性淀粉为唯一碳源时，菌丝生长速度最快（P＜0.05），为 0.83 cm·d-1，且菌丝致密、粗壮、有活力。因此确定可溶性淀粉为最佳碳源，最佳浓度为 20 g·L-1。

最佳氮源及最佳浓度的筛选结果见图2。

图2 最佳氮源（A） 及最佳浓度（B） 筛选Fig.2 Screening of optimal nitrogen source(A)and concentration(B)

如图2所示，8种氮源均能促进菌丝生长，其中以蛋白胨为唯一氮源时，菌丝生长速度最快（P＜0.05），为0.76 cm·d-1，所以确定蛋白胨为最佳氮源，最佳浓度为5 g·L-1。

最佳无机盐及其添加浓度的筛选结果见图3。

图3 最佳无机盐（A）及最佳浓度（B）筛选Fig.3 Screening of optimal inorganic salt(A)and optimal concentration(B)

如图3所示，8种无机盐均能促进菌丝生长，其中以KH2PO4为唯一无机盐时，菌丝生长速度最快（P＜0.05），为 0.65 cm·d-1，所以确 KH2PO4为最佳无机盐，最佳浓度为1.5 g·L-1。

最佳生长因子及其添加浓度的筛选结果见图4。

图4 最佳生长因子（A）及最佳浓度（B）筛选Fig.4 Screening of optimal growth factor(A)and optimal concentration(B)

如图4所示，8种生长因子均能促进菌丝生长，其中以叶酸为唯一生长因子时，菌丝生长速度最快（P＜0.05），为 0.61 cm·d-1，因此确定叶酸为最佳生长因子，最佳浓度为10 mg·L-1。

2.1.2 母种培养基组分正交试验

选择单因素试验最佳碳源可溶性淀粉、最佳氮元蛋白胨、最佳无机盐KH2PO4、最佳生长因子叶酸进行正交试验优化分析，优化结果见表3。

表3 母种培养基组分的正交试验优化结果Tab.3 Orthogonal experimental optimization results of the medium compositions for stock culfure

由表3极差R值可知，可溶性淀粉、蛋白胨、KH2PO4、叶酸4个因素对羊肚菌菌丝生长速度的影响主次顺序为：蛋白胨>可溶性淀粉>KH2PO4>叶酸（B>A>C>D）。正交试验表明，羊肚菌菌丝生长的最佳培养基为：A2B2C3D2（可溶性淀粉20 g·L-1、蛋白胨5 g·L-1、KH2PO42 g·L-1、叶酸10 mg·L-1）。同时对正交结果进行方差分析，结果见表4。

表4 母种培养基组分正交试验方差分析Tab.4 Variance analysis of orthogonal test of medium compositions for stock culture

由表4可知，4个影响因素中，可溶性淀粉、蛋白胨、KH2PO4均达到极显著水平，生长因子影响不显著，即其对菌丝生长速度的影响顺序为：蛋白胨>可溶性淀粉>KH2PO4>叶酸（B>A>C>D）。其中氮源影响最大，与极差分析结果基本一致，因此确定母种最佳培养基配方为：可溶性淀粉20 g·L-1，蛋白胨 5 g·L-1，KH2PO42 g·L-1，叶酸 10 mg·L-1。

2.1.3 验证试验结果

为检验培养基优化工艺的可信度，结合实际试验操作的可行性，采用最优培养基组合为可溶性淀粉 20 g·L-1、蛋白胨 5 g·L-1、KH2PO42 g·L-1、叶酸10 m g·L-1，进行5次验证试验，得到羊肚菌菌丝平均生长速度的验证值为（1.54±0.05） cm·d-1。该结果明确了利用正交试验法优化羊肚菌母种培养基的最佳工艺是有效可行的。

2.2 母种培养条件优化结果

2.2.1 母种培养条件单因素试验结果

母种培养基培养条件优化结果见图5。

图5 培养条件单因素试验筛选Fig.5 Single factor test screening of cultivation conditions

由图5A可知，在透光率为0～20%的条件下菌丝生长速度不断增加。当透光率为20%时，菌丝生长速度达到最大，为1.24 cm·d-1；在透光率为20%～100%时菌丝生长速度缓慢下降。因此，最优透光率初步确定为20%。

母种培养基pH优化结果见图5B。由图5B可知，初始pH为5.5～6.5时菌丝生长速度不断增加；当pH为6.5时，生长速度达到最大，为1.35 cm·d-1；pH为6.5～8.5时菌丝生长速度缓慢下降。因此，最佳母种培养基pH确定为6.5。

母种培养基培养温度优化结果见图5C。由图5C可知，在20℃～24℃时，随着温度的上升菌丝生长速度不断增加；当温度为24℃时，生长速度达到最大，为1.32 cm·d-1，在24℃～28℃条件下菌丝生长速度缓慢下降。因此，培养温度初步确定为24℃。

2.2.2 母种培养条件正交试验

由母种培养基单因素试验最佳条件所设计的母种培养基培养条件正交试验结果见表5。

表5 母种培养条件正交试验结果Tab.5 Results of orthogonal test on cultivation conditions for stock culture

由表5极差R值可知，可透光率、初始pH、温度3个因素对羊肚菌菌丝生长速度影响主次顺序为：透光率>初始pH>温度（A>B>C）。正交试验表明，能够使菌丝生长效果最好的培养条件为：A2B2C3（透光率20%、初始pH 6.5、培养温度26℃）。同时对正交表进行方差分析，结果见表6。

表6 母种培养条件正交试验方差分析Tab.6 Variance analysis of orthogonal test of cultivation conditions for stock culture

由表6可知，3个影响因素中，透光率、初始pH达到极显著水平，温度达到显著水平，即其对菌丝生长速度影响的大小顺序为A>B>C，其中透光率影响效果最显著，与极差分析结果基本一致。因此确定培养母种最佳环境条件为：透光率20.0%、初始pH 6.5、培养温度26℃。

3 结论

在单因素试验基础上采用正交优化试验分别对羊肚菌的母种培养基组分及培养条件进行优化，确定最佳营养条件为：可溶性淀粉20.0 g·L-1、蛋白胨5.0 g·L-1、KH2PO42.0 g·L-1、叶酸 10.0 m g·L-1；最佳母种环境条件为透光率20.0%、pH 6.5、温度26.0℃。通过对母种营养条件及环境条件的优化，使羊肚菌菌丝在营养生殖阶段初期生长速度快、发菌整齐致密、爬壁有力，为母种保藏、原种及栽培种制备提供了有力保障。