黑木耳59个菌株的遗传多样性分析*

潘春磊，王延锋，盛春鸽，王金贺，张 鹏，于海洋

（黑龙江省农业科学院牡丹江分院，黑龙江 牡丹江 157000）

黑木耳（Auricularia heimuer） 又名光木耳、云耳，隶属于担子菌门（Basidiomycota） 伞菌纲（A－garicomycotina） 木耳目 （Agaricomycetes） 木耳科（Auriculariales） 木耳属 （Auricularia）[1]。黑木耳营养丰富，子实体中含有蛋白质、膳食纤维、多糖、氨基酸、黄酮、多酚等物质[2-5]，微量元素中尤其以铁的含量最为丰富[6]，被誉为食品中的“含铁冠军”。黑木耳人工栽培起源于我国，在我国广泛栽培，目前是我国继平菇（Pleurotus ostreatus）、香菇（Lentinus edodes） 后的第三大栽培食用菌[7-9]，我国也是世界黑木耳产业发展最好的国家，据悉，我国的黑木耳产能高达世界总产能的90%以上[10]。

黑木耳产业的快速发展，导致其品种数量也急速增加，然而由于食用菌菌种和种质资源的特殊性，导致市场上存在着大量同物异名的现象，极大地限制了食用菌产业的健康发展，因此，对种质资源进行鉴定和评价分析就显得尤为重要。SSR分子标记技术在种质资源的鉴定评价方面应用极为广泛[11]，卜海东等[12]利用SSR分子标记结合表型形状构建了寒地梨资源核心种质，李慧等[13]基于SSR标记构建了平菇栽培品种核心样本。徐安然等[14]构建了木耳部分种质资源的SSR分子身份证。王新新等[15]通过SSR构建了29份双孢蘑菇菌株的分子身份证，为双孢蘑菇种质资源的研究评价提供了参考。

以农艺性状为基础的遗传多样性研究在植物上得到了广泛的应用[16]。张向前等[17]对多个燕麦的农艺性状进行调查；陈影等[18]对木耳进行了以农艺性状为主的多样性分析，研究燕麦种质资源的遗传多样性；常艳等[19]对糙皮侧耳的农艺性状进行研究，探讨各个性状间的相关性；盛春鸽等[20]以平菇农艺性状为基础，分析了外引群体和国内群体的遗传差异。以表型为基础的遗传多样性研究国外也有个案，Horvath等[21]通过对梨资源的农艺性状进行调查，研究其表型多样性和遗传结构，Szamosi等[22]对甜瓜种质资源进行了农艺性状多样性分析。

以保藏在黑龙江省农业科学院牡丹江分院的59株主栽黑木耳菌株为试验材料，通过分子鉴定和农艺性状调查等方法，对这些菌株的遗传多样性进行了客观的评价，同时也为黑木耳种质资源研究提供了一定的理论支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料黑木耳菌株59株，库存编号AU60～AU96、AU106～AU127，保藏在黑龙江省农业科学院牡丹江分院食用菌研究所。

1.2 试验方法

1.2.1 供试培养基

1）马铃薯综合培养基（PDA培养基）。

2） 原种和栽培种培养基：木屑78%、麦麸10%、稻糠10%、石灰1%、石膏1%，含水量65%。

1.2.2 全基因组DNA的提取

菌丝DNA的提取使用植物基因组DNA提取试剂盒DP305-03，购自天根生化科技有限公司。

1.2.3 SSR引物、PCR反应体系及数据处理

SSR引物、PCR反应体系及数据处理方法参考徐安然等[10]的研究结果。引物详情见表1。

表1 引物名称及序列Tab.1 Primer name and primer sequence

PCR扩增反应体系：dNTPs 2 μL（2.5 mmol·L-1）、引物0.2 μL～0.3 μL（0.2 mmol·L-1）、10×Ex Taq PCR buffer 2 μL、Ex Taq 0.1 μL（5 U·μL-1）、DNA模板 0.4 μL～0.5 μL，ddH2O 补至 20 μL。

反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，56℃～60℃复性 30 s，72℃延伸 30 s，30 个循环；72℃补齐10 min。聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。

1.2.4 表型试验设计及出耳管理

试验于2017年～2019年3年春季在黑龙江省农业科学院牡丹江分院食用菌示范园区内完成，采用随机区组设计，3个重复，每个重复60袋。黑木耳栽培采用全光地摆模式，集中开口、集中催芽、集中出耳，割口方式为“Y”字型口。栽培期间注意通风和保持湿度，防止杂菌滋生，特别在耳芽形成后，既要保证湿度又要保证氧气充足。子实体生长期时，采用“干干湿湿”交替管理方法，直至木耳成熟，进行采摘。

1.2.5 农艺性状测定

供试菌株农艺性状指标和测定方法参考陈影等[23]的部分指标和方法，详见表2。

表2 黑木耳15个农艺性状的测定方法Tab.2 Value assignment of 15 agronomic traits for Auricularia heimuer

1.2.6 数据处理和统计分析

对原基颜色等7个非数值性状按照表2所示进行分级赋值后再做数据分析，对其他8个数值性状进行质量化处理，依照王述民[24]描述的方法进行统计，分为10级，1级XiX+2σ，中间每级间隔0.5σ。使用SPSS 23软件进行聚类及主成分分析，聚类时种质间距离采用欧氏距离，类平均（unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA） 法。多样性指数的计算采用Shannon-Weaver信息指数。

2 结果与讨论

2.1 基于SSR遗传多样性分析

基于SSR进行遗传多样性分析，59个黑木耳菌株的聚类树状图见图1。

图1 59个黑木耳菌株的SSR聚类树状图Fig.1 Dendrogram by cluster analysis based on SSR genetic similarity of 59 strains of Auricularia heimuer

如图1所示，根据8对多态性引物的扩增结果，59个种质间的遗传相似性系数0.42～1.00，且相似性系数在0.56处将59个菌株分成4大类，其中最大一类样本容量较大，共41个菌株。这可能是由于长期人工选择，导致了杂交育种亲缘关系较近的缘故。

2.2 黑木耳农艺性状遗传多样性分析

59个菌株的农艺性状研究数值统计见表3。

表3 59个黑木耳菌株农艺性状统计分析Tab.3 The statistic data of 59 strains of Auricularia heimuer based on agronomic traits

由表3可知，供试菌株的15个农艺性状间存在不同程度的遗传变异，变异系数范围为6%～46%，其中变异最小的是原基形成时间，变异最大的是子实体边缘特性。遗传多样性指数变化范围为0.435～2.048，多样性指数最小的是原基形成时间，耳片厚度指标的遗传多样性指数最大。

2.3 农艺性状聚类分析及产量回归模型的构建

15个农艺性状的欧式距离聚类分析结果见图2。

图2 15个农艺性状的聚类分析Fig.2 Cluster analysis of 15 agronomic traits

如图2所示，在欧氏距离10.0处，15个农艺性状被分为两大类。第一类涵盖了子实体形状、子实体腹面褶皱、子实体背面褶皱、子实体边缘特性、原基颜色、子实体颜色等11个农艺性状，以赋值性状为主，表明这些赋值性状彼此之间的相关性较高。第二类涵盖了产量、耳片长度、耳片宽度等信息，表明这几个性状间存在一定程度的相关性。

通过此证据进一步利用SPSS软件对数据进行挖掘，通过多元逐步回归分析的方法构建产量（Y）与发菌时间（X1）、耳片厚度（X2）、耳片长度（X3）、耳片宽度（X4）之间的最优回归模型，得到的回归方程式为：

由此可见，产量和发菌时间、耳片厚度、耳片长度呈正相关，与耳片宽度呈负相关。产量性状与其关系紧密的4个性状相关程度依次为：耳片厚度（X2）>耳片宽度（X4）>发菌时间（X1）>耳片长度（X3）。在其他变量保持不变的前提下，耳片厚度每提升一个单位，产量会相应的提升6个单位，耳片厚度是影响产量的重要指标之一。

2.4 主成分分析

对59个菌株的15个农艺性状进行主成分分析，结果见表4。

表4 主成分分析方差解释Tab.4 Total variance explained by principal component analysis

由表4可知，前4个主成分的累积贡献率为96.067%，表明这4个因子所含的信息可解释全部信息量的96%，符合分析要求。

对前4个主成分的载荷矩阵进行分析，见表5。

表5 主成分载荷矩阵Tab.5 Principal component loading matrix

由表5可知，耳片长度、耳片宽度在第1个、第3个主成分上有较高的载荷值，这2个主成分主要解释了这2个变量，可以把第1个和第3个主成分综合解释为子实体形态性状指标；产量和耳片宽度2个性状在第2个主成分上有较高的载荷值，可以把第2个主成分解释为产量因子；发菌时间和原基形成时间2个性状在第4个主成分上有较高的载荷值，可以把第4个主成分解释为营养发育因子。此4个主成分分别从营养发育角度、子实体形态性状角度和产量角度综合评价了木耳菌株。同时这些性状也是作为木耳菌株特性评价的主要指标。

2.5 基于农艺性状对59个菌株的聚类分析

对59个木耳菌株15个农艺性状进行欧式距离聚类分析，结果见图3。

图3 基于农艺性状对59个木耳菌株的聚类分析Fig.3 Cluster analysis of 59 strains of Auricularia heimuer based on agronomic traits

如图3所示，在欧式距离20的水平上将供试菌株分为两大类。综合SSR聚类分析结果和农艺性状可知，此聚类图与SSR聚类结果关联度不大，与农艺性状关联度很大。类群1包括AU95、AU113等25个菌株，其最典型的特征是子实体多为典型的元宝型，腹面和背面的褶皱多为平滑型。类群2包括AU71、AU117、AU126等34个菌株，这个类群在欧式距离为16的水平上又分为3个亚类，总体来讲，尽管有AU64、AU79、AU70等少数几株元宝型子实体菌株编入了这个类群，但这个类群的木耳子实体多数为菊花型，且腹面背面的褶皱明显。

3 讨论

木耳种质资源的评价研究多集中在分子标记的研究方面[25-26]，但近年来基于农艺性状的多样性研究也愈来愈多，农艺性状是实际的感官或测量指标，作为评价种质资源多样性研究的指标一直扮演着极其重要的角色。以农艺性状指标为基础，结合SSR分子标记，评价了59个木耳菌株的遗传多样性，最终发现分子指标的聚类结果和子实体的农艺性状没有必然联系，两者只能从不同角度揭示菌株间的遗传差异。

基于农艺性状的菌株聚类结果将供试菌株分为两大类群，与子实体形状及耳片腹面、背面的褶皱情况有极大的关系，但是与耳片长、宽、厚等指标关系不大。15个农艺性状的聚类结果表明，各农艺性状间存在一定的联系。多元逐步回归表明，木耳的产量和发菌时间、耳片长度、宽度、厚度具有一定的线性关系。在木耳育种进程中，要充分协调好外观、品质、产量等性状，依据科学的指导和管理，提高生产效益。