蜡样芽孢杆菌XZ30-2发酵液对黑曲霉的控制及安全性评价

伊艳杰，刘阳，侯志鹏，赵书云，陆恒，贾劭，李瑞芳

（河南工业大学生物工程学院，郑州市生物医药功能分子重点实验室，河南郑州 450001）

由霉菌引起的粮油食品变质给食品工业造成了重大经济损失[1,2]。霉菌属中最常见的是黑曲霉，它是粮食储藏过程中的优势微生物，可以污染不同阶段的农产品，如收获前、收获后、加工和处理阶段，它的存在对储藏粮食的品质影响甚大[3,4]。根据联合国粮农组织的统计数据，每年全球平均有 2%的粮食因为霉变而不能食用，有的粮油食品从外表上虽然看不出有霉变，但已受霉菌毒素污染，当毒素被人体误食或被皮肤吸收后，常会引起人体机能减退、患病甚至导致死亡[5-7]。

在过去几十年中，使用化学防腐防霉剂作为抗菌剂来控制粮食变质已成为一种常用手段。然而，随着消费者对天然、健康食品的日益关注，食品加工商开始寻找更安全的替代品来取代化学添加剂[1,8]。生物防治已被逐渐应用于食品安全控制中[9]，芽孢杆菌属（Bacillusspp.）在自然界中广泛存在，与传统的益生菌相比，芽孢杆菌发挥作用的主要成份是芽孢体，对温度具有较高耐受性，可以在室温下长期储存，也可以在不同的pH环境下储存[10]。詹艺舒等[11]从空气、竹子内生细菌中筛选出一株甲基营养型芽孢杆菌Z21，发现该菌株的无菌发酵液对黑曲霉、康氏木霉、绿色木霉等病菌有较强的抑制作用；Podile等[12]研究的枯草芽孢杆菌AF1使黑曲霉的细胞壁受损，进而抑制黑曲霉的生长；Hassan等[13]研究的地衣芽孢杆菌BL350-2不仅可以抑制黑曲霉MC5的生长，并且可以降低真菌毒素的合成；Öztopuz等[14]分离出6株芽孢杆菌可以抑制黑曲霉EGE-K-213的孢子萌发和菌体生长。蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）产生的多种活性物质，例如低分子多肽、脂肽类抗生素和抗菌蛋白等[15,16]，可以有效抑制多种病原微生物的生长，具有良好的研究和应用价值。蜡样芽孢杆菌在小麦的黑曲霉防治应用方面鲜见报道。本研究对蜡样芽孢杆菌XZ30-2的发酵液进行稳定性分析、小麦黑曲霉防治效果测定和动物安全性评价，以推动菌株XZ30-2发酵液在食品安全控制领域的开发和应用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蜡样芽孢杆菌XZ30-2（MZ646135）和黑曲霉均为本实验室-80 ℃保存菌株；KM 小鼠（许可证号SCXK（豫）2015-0004），体重18～22 g，购自河南省实验动物中心，SPF级，雌雄各半，健康状况良好。

葡萄糖、可溶性淀粉，天津市瑞金特化学品有限公司；NaCl，天津市德恩化学试剂有限公司；豆粕，市售；蛋白胨、酵母浸粉，北京奥博星生物技术有限责任公司；琼脂粉，北京索莱宝科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 生防细菌的抑菌能力检测

采用平板对峙法测定蜡样芽孢杆菌XZ30-2的抑菌活性[17]，在平板中央接种黑曲霉，28 ℃培养1 d后，在十字线适当距离接种细菌XZ30-2，每组3次重复，在28 ℃培养箱培养5 d后，测量拮抗菌与病原菌之间的距离即拮抗带，拮抗带的大小反映XZ30-2对黑曲霉的抑制能力。

1.2.2 发酵液的制备及抑菌活性测定

参考Shen等[18]方法，将拮抗细菌XZ30-2活化培养后，挑取单菌落于20/100 mL LB液体培养基中，37 ℃，160 r/min摇瓶培养10～12 h。然后按照发酵液4%的接种量，接种到100/250 mL LB液体培养基中，36 ℃，160 r/min摇瓶培养48 h。经4 ℃，11000 r/min离心15 min，0.22 μm无菌滤膜过滤，收集上清液，4 ℃冰箱保存备用。采用生长速率法[19]测定不同因素处理下发酵液的抑菌率。

1.2.3 发酵液的稳定性分析

参考赵雅等[20]方法进行XZ30-2发酵液的稳定性测定。

（1）热稳定性

将发酵液分别在室温约20（对照）、50、60、70、80、90和100 ℃等条件下恒温2 h，每个处理重复3次。采用生长速率法[19]测定不同温度处理下发酵液的抑菌率。

（2）酸碱稳定性

将发酵液用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH分别调整pH值为1、3、5、7、9、11和13，静置2 h后调至pH值为7（自然pH），以pH为7处理的发酵液作为对照，每个处理重复3次。采用生长速率法[19]测定不同pH处理下发酵液的抑菌率。

（3）紫外光稳定性

将发酵液分成5等份，置于距离20 W紫外灯30 cm处，分别照射30、60、90、120和150 min，以未经紫外线处理的发酵液为对照，每个处理重复3次。采用生长速率法[19]测定不同紫外光处理下发酵液的抑菌率。

（4）自然光稳定性

将发酵液分成7等份，放置于4500 lx光照培养箱正中央，依次经过0、1、2、4、8、16和32 h白光照射后取出，每个处理重复3次。采用生长速率法[19]测定不同日光处理下发酵液的抑菌率。

1.2.4 发酵液冻干粉的制备及其对黑曲霉防治效果测定

将XZ30-2的发酵液经真空冷冻干燥制备成冻干粉于-20 ℃保存备用。发酵液冻干粉对小麦感染黑曲霉的防治研究参照袁远等[21]的方法并适当修改。对照组和处理组小麦分别加入 4%的黑曲霉孢子悬浮液混匀，处理组小麦中加入5 mL 1%的冻干粉和15 mL无菌水混合均匀，对照组小麦中加入20 mL无菌水混合均匀，用保鲜膜密封后置于28 ℃培养箱培养，7 d后观察小麦感染黑曲霉的发病状况。

1.2.5 动物安全性分析

KM小鼠饲养于温度22 ℃，相对湿度40%～70%的动物房。动物食用饲料和饮用水经高压灭菌处理，参照田原等[22]的方法饲养小鼠。

1.2.5.1 急性经口毒性实验

采用最大剂量耐受法[23,24]，以5 000 mg/kg·bw剂量为最大剂量，取0.5 g发酵液冻干粉溶于9.5 mL无菌水中，得到5%浓度的发酵液溶液。每组动物10只，雌雄各半。适应性饲养3 d后，处理组用发酵液冻干粉溶液20 mL/kg·bw灌胃，对照组用同体积无菌水灌胃。分别于第0、2、4、8和14 d称量各组小鼠体重，观察小鼠的中毒表现及死亡情况，记录小鼠的毛皮、眼睛、肢体活动和行为等改变情况，注意是否出现抽搐、腹泻、流涎、嗜睡和昏迷等症状，记录中毒体征出现和消失的时间以及死亡时间。

1.2.5.2 小鼠血液生理指标测定

小鼠经过14 d灌胃处理后，取血样前16 h断食，不断水，采用乙醚麻醉后，进行心脏取血装入灭菌的1.5 mL离心管，将血样静置1～3 h，经3000 r/min离心10 min，用移液器吸取血清，使用生化分析仪测定各项血清学生理指标[25,26]，包括谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、尿素氮（BUN）和肌酐含量（CREA）[27,28]。

1.2.5.3 病理学检查

14 d后对用乙醚麻醉后的小鼠进行尸检，摘取心脏、肝脏、脾脏和肾脏等脏器，观察各组脏器器官的颜色，形态是否异常，针对病变的脏器需要进行组织病理学检测，最后用生理盐水冲洗脏器，滤纸吸干后称重，测得各组器官的脏器指数[29]。

1.3 数据分析

运用SPSS 20.0分析各组实验数据的方差，并采用Duncan氏新复极差法分析实验数据的差异显著性[30]。

2 结果与讨论

2.1 蜡样芽孢杆菌XZ30-2对黑曲霉的抑制

采用平板对峙法检测XZ30-2对黑曲霉的抑制，由图1可知，拮抗带宽5.32 mm，说明蜡样芽孢杆菌XZ30-2菌株对黑曲霉有较强的抑制作用。通过生长速率法测出 XZ30-2发酵液对黑曲霉的抑制率为54.31%。

2.2 发酵液的稳定性分析

2.2.1 温度对发酵液抑菌稳定性的影响

不同温度处理与对照组（室温）相比，当发酵液经过 50、60 ℃处理后，其对黑曲霉的抑菌活性无显著变化，当处理温度上升到 70 ℃后，抑菌活性开始降低，经过100 ℃处理后，抑菌率降低了31.86%，与对照组相比差异显著（见图 2a），表明发酵液经过高温处理后不具有良好的耐热性。黄伟等[31]研究发现，贝莱斯芽胞杆菌JK19发酵液经过80 ℃处理后抑菌圈直径开始下降，抑菌圈直径下降了28%；贾淑颖等[32]研究苏云金芽孢杆菌Bt185和HD-1菌株的发酵上清液，经过50 ℃处理后，抑菌圈明显变小，80 ℃处理后几乎没有抑菌圈，即抑菌物质逐渐失活。表明发酵液中含有易受温度影响的物质，可能是某种多糖或者蛋白质[33,34]。

2.2.2 酸碱对发酵液抑菌稳定性的影响

发酵液在pH 5～9范围处理时，其抑菌活性相对稳定。在强酸或强碱条件下，发酵液对黑曲霉的抑菌率降低，与对照相比呈显著性差异（见图 2b），表明发酵液不耐强酸和强碱，适宜 pH为 5～9，抑菌率为48.59%。与Jiang等[35]研究中的AspergillusAs-75的发酵液在pH为6的弱酸性条件下，抗菌活性稳定，在强酸和强碱条件下，抑菌圈最大降低9.9 mm结果相似。随着pH的变化，发酵液会出现沉淀的现象，可能是脂肽类物质发生了酸沉淀[36]。

2.2.3 紫外光照射对发酵液抑菌稳定性的影响

发酵液经不同时间紫外光照射后，随着照射处理时间延长至150 min，抑菌率降低了1.69%，与对照组相比其抑菌活性无显著影响（见图2c），表明发酵液对紫外光长时间的照射有较好的稳定性。这一结果与Liu等[37]研究的Marine StreptomycesGB-2发酵液经紫外光照射处理24 h抑菌直径基本不变的现象相同。

2.2.4 日光照射对发酵液抑菌稳定性的影响

发酵液经不同日光照射处理0～32 h后，与对照组相比，其抑菌活性未发生变化。当日光持续照射32 h后，其抑菌率为52.45%（见图2d）。表明发酵液具有较好的自然光稳定性。与刘小玉等[38]研究的解淀粉芽孢杆菌 ck-05在自然光持续照射 24 h后抑菌率为64.81%，与对照组相比无明显变化趋势的结论保持一致。

2.3 蜡样芽孢杆菌XZ30-2发酵液冻干粉对黑曲霉的防治效果

蜡样芽孢杆菌XZ30-2的发酵液经过冷冻干燥，每100 mL发酵液可得150 mg冻干粉，混合黑曲霉孢子悬浮液的小麦籽粒经过发酵液冻干粉溶液处理后，在28 ℃培养7 d后，和对照组相比，没有大片明显的黑曲霉菌落（见图3）。说明该发酵液对高水分含量的小麦有着明显的的防霉效果。

表1 XZ30-2发酵液对各组小鼠生长情况的影响Table 1 Effects of XZ30-2 fermentation supernatant on the growth of mice in each group

2.4 蜡样芽孢杆菌XZ30-2发酵液的动物安全性评价

2.4.1 XZ30-2发酵液冻干粉对小鼠的生长和死亡的影响

小鼠在动物房经过两天适应性饲养，各组小鼠的体重之间差别不明显，说明该实验动物具有可实验性。小鼠经过发酵液灌胃后，采取自由饮食，在0、2、4、8和14 d同一时间对小鼠进行称重，在早期灌胃后，小鼠体重增加速率稍有降低，在第8 d后恢复正常生长速度。第14 d试验组与对照组相比，体重变化差异不显著(见表1)，说明发酵液对小鼠并无促进发育或抑制发育的情况，且各组均没有出现死亡。周淑贞等[39]研究的短小芽孢杆菌B102口服菌液对小白鼠无致病性，生长期间未出现死亡，与本研究结果一致，表明XZ30-2发酵液对小鼠生长无致病性。

2.4.2 XZ30-2发酵液冻干粉对小鼠器官指数的影响

在对小鼠进行发酵液灌胃的14 d后，解剖观察小鼠脏器。结果显示，处理组小鼠脏器颜色、大小和形态与对照组一致，处理组与对照组均无可见病变，与林松泉等[40]研究的凝结芽孢杆菌ZC-1安全性实验中剖检小鼠，未见任何器官、消化道出现病变结果一致；Shobharani等[41]研究的弯曲芽孢杆菌MCC2427和地衣芽孢杆菌MCC2512对大鼠进行90 d的灌胃，生命器官组织的颜色、大小、硬度正常，未发生病变。本实验结果表明，小鼠经过发酵液14 d灌胃后，脏器组织无明显病理变化，经过称重计算得出脏器指数如表2，处理组与对照组数据均无显著性差异，说明蜡样芽孢杆菌XZ30-2发酵液对小鼠的脏器指数没有显著影响，表明其对小鼠是安全的，无毒副作用。

表2 XZ30-2发酵液对各组小鼠脏器指数的影响Table 2 Effects of XZ30-2 fermentation supernatant on organ index of mice in each group

2.4.3 XZ30-2发酵液冻干粉对小鼠血清生理指标的影响

在对小鼠进行发酵液灌胃的14 d后，检验小鼠血清生理指标ALT、AST、BUN和CREA。如表3所示，与参照范围形成对比，KM小鼠雄性的ALT高于参照值，但是处理组和对照组相比差异不大，说明XZ30-2发酵液对ALT不具有显著影响，可能是外界因素的影响导致小鼠ALT上升。另外小鼠的BUN均高于正常值；CREA均低于正常值，雌性处理组的BUN和对照组含量 14.50 mmol/L相比，BUN降低了 5.14 mmol/L。BUN是蛋白质代谢的重要产物，蛋白质的被利用程度是反映机体适应力大小的指标之一[42]，雌性的BUN下降说明XZ30-2发酵液可以提高雌性机体的适应能力；王岩等[43]研究的解淀粉芽孢杆菌 SSY1对小鼠进行了急性毒性和慢性毒性试验，CREA均低于参照值，但和对照组相比不具有显著性，基本体现小鼠正常的生理状态。由此表明，该剂量对小鼠机体未造成损伤，XZ30-2发酵液对动物的安全性良好。

表3 小鼠的血清生理指标Table 3 The serological physiological indexes of mice in each group

3 结论

蜡样芽孢杆菌XZ30-2对黑曲霉具有较好的抑菌效果，发酵液抑菌率为54.31%。蜡样芽孢杆菌XZ30-2发酵液对紫外光、日光、pH 5～9具有较强的耐受性，随着温度升高至 70 ℃时抑菌效果开始下降。在对郑麦366进行防霉测定中，处理组相比对照组无大面积明显可见的黑曲霉菌落，XZ30-2发酵液具有良好的防霉效果。采用发酵液冻干粉溶液对小鼠进行14 d灌胃期间，小鼠行为动作和体态正常、体重增加正常，未出现异常行为和死亡现象；小鼠经解刨后，处理组小鼠脏器的颜色、大小和形态与对照组一致，处理组与对照组均无可见病变；XZ30-2发酵液未对小鼠的肝功能和肾功能指标产生负面影响，确定XZ30-2发酵液是安全、无毒的，可以被进一步开发应用。