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基于Au-Fe3O4纳米颗粒的磁弛豫免疫传感器快速检测食源性单核细胞增生李斯特菌

2022-02-15董永贞陈翊平

现代食品科技 2022年1期
关键词:食源性李斯特探针

董永贞,陈翊平

(华中农业大学食品科学技术学院,湖北武汉 430070)

食源性致病菌引发的食源性疾病是国际公共卫生领域最受关注的食品安全问题之一。目前,常见的食源性致病菌主要包括单核细胞增生李斯特菌(简称单增李斯特菌,Listeria monocytogenes)、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等。其中,单增李斯特菌因其环境适应能力强、危害严重、分布广泛等特性被列为重点检测对象。单增李斯特菌是一种嗜冷的人畜共患病原菌,能够在低温下长时间存活,易在食品加工生产链中传播,且难以被灭杀[1-3]。人体感染后会引起流感样疾病、脑膜炎、败血症等,严重时危及生命,致死率高达20%~30%[4-7]。单增李斯特菌引发的食品安全事件也屡见不鲜。因此,对单增李斯特菌进行有效的监控是保障人体健康、降低经济损失、提升社会效益的重要手段。

目前针对单增李斯特菌的常规检测方法主要包括以下三类[8-10]:(1)培养鉴定法;(2)免疫分析法,如酶联免疫吸附法和胶体金免疫层析法等[11];(3)基于聚合酶链式反应(PCR)的分子生物学方法,如荧光定量PCR方法、微滴数字PCR方法、多重PCR方法等[12-13]。虽然已有多种用于单增李斯特菌定量定性的检测方法,但以上方法在一定程度上存在增菌时间长、样品前处理复杂、成本高等问题,难以满足高流行性的单增李斯特菌现场、快速检测的需求。

生物传感器是一类近年来发展迅速、性能优异的快速检测方法。生物传感器以生物分子(如抗体、核酸等)作为识别元件,通过信号转化器将识别信息转换为便于检测的光、电、磁等信号,从而实现目标物的快速分析[14]。目前,已有大量报道将生物传感器用于单增李斯特菌的快速检测[15-18]。不同于光、电信号,磁信号在食品基质中背景低,在检测过程中具有更高的信噪比。而基于磁信号的磁弛豫免疫传感器也逐渐步入广大研究者的视野。传统的磁弛豫(magnetic relaxation switching,MRS)免疫传感器是以偶联有致病菌单克隆捕获抗体和识别抗体的超顺磁纳米颗粒为磁信号探针,通过免疫反应诱导磁探针聚集,引起磁信号增强,从而实现目标致病菌快速检测的均相免疫分析方法[19]。虽然传统磁弛豫免疫传感器具有样品前处理简单、信噪比高等优点,但传统的磁弛豫免疫传感器线性范围较窄,灵敏度不足,易受基质干扰而引起非特异性聚集,无法实现食源性致病菌的灵敏准确分析[20,21]。开发高性能的磁探针和探索有效的信号转化机制是解决这一问题的有效途径。

本研究设计并合成了一种双球状的 Au-Fe3O4二聚体纳米颗粒,并以其为磁信号探针,开发了一种过氧化氢介导的 Ag@Au-Fe3O4磁探针组装信号传感策略。在此基础上,构建了新型的 MRS免疫生物传感器,用于食品中单增李斯特菌的快速、高灵敏检测,以期为食源性致病菌的快速检测提供有力的工具。

1 材料与方法

1.1 菌株与试剂

本研究中涉及的单核细胞增生李斯特氏菌ATCC 19115,单核细胞增生李斯特菌CMCC 54002、威尔斯李斯特菌ATCC 35897、绵羊李斯特菌ATCC 19119、副溶血弧菌ATCC 17802、肠炎沙门氏菌ATCC 14028、大肠杆菌 ATCC 25922和金黄色葡萄球菌 ATCC 29213,均在本实验保存。

羧基修饰的磁性纳米颗粒(MNP180)(直径为180 nm;10 mg/mL),Thermo Fisher Scientific公司。单增李斯特菌抗体,美国 GeneTex公司。牛血清白蛋白(BSA),1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺活性酯(NHS),上海阿拉丁生化科技股份有限公司。胰酪胨大豆酵母浸膏肉汤(TSB)和胰酪大豆胨琼脂培养基(TSA),青岛海博生物技术有限公司。其他普通的试剂均为化学分析纯,上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 主要仪器与设备

便携式磁分离架,美国Ocean NanoTech公司;低场核磁共振仪(Low field nuclear magnetic resonance spectrometer,LF-NMR),纽迈分析仪器股份有限公司(中国上海);旋转混匀仪,大龙兴创实验仪器股份公司;MS-3涡流旋转振荡器,德国IKA公司;电热恒温培养箱,天津市泰斯特股份有限公司。

1.3 菌株活化和菌液制备

将冻存的单增李斯特菌菌种在常温下解冻,并通过平板划线法,在TSA培养基上对其进行活化(37 ℃下恒温培养 18 h)。然后,选取单个典型菌落接种于TSB液体培养基中,在37 ℃下恒温震荡(转速为180 r/min)培养24 h。吸取培养后的菌液1 mL于1.5 mL无菌离心管中,10000 r/min离心3 min,除去上清,用0.9%生理盐水洗涤2次并重悬,通过平板计数法确定菌数,得到浓度为108CFU/mL的菌液备用。

1.4 Ag(NH3)2OH溶液的配制

将200 μL氨水(15 mol/L)加入到6 mL AgNO3(0.1 mol/L)中,并混合均匀。然后加入3 mL KOH(0.8 mol/L)溶液,并继续缓慢加入190 μL氨水(15 mol/L)。最后加入25 mL去离子水得到Ag(NH3)2OH溶液,保存在4 ℃备用。

1.5 Au-Fe3O4纳米磁探针的合成

本实验首先参考曾景斌等人[22]的方法合成了Fe3O4纳米磁颗粒。在此基础上,将1.25 mL HAuCl4(10 mmol/L),5 mg柠檬酸三钠,0.5 mL Fe3O4纳米磁颗粒加入到沸腾去离子水中,并保持30 min。离心洗涤后,得到Au-Fe3O4纳米磁探针。

1.6 MNP180-Ab1的制备

在 1 mg MNP180溶液中加入 50 μL EDC(10 mg/mL)和25 μL NHS(10 mg/mL),在室温下缓慢震荡反应15 min。磁分离并除去上清液后,用PBS缓冲液重悬,并加入 40 μg单增李斯特菌的捕获抗体(Ab1),在室温下缓慢震荡反应 2 h。磁分离并除去上清液后,加入500 μL含3%牛血清白蛋白的PBS溶液,在室温下封闭1 h。封闭结束后用PBST(含0.05%吐温 20的 PBS)缓冲液洗涤 3次并重悬,得到的MNP180-Ab1的保存于4 ℃备用。

1.7 Ag@Au-Fe3O4-MRS免疫传感器的构建并用于单增李斯特菌的定量分析

在 100 μL MNP180-Ab1中分别加入 100 μL 单增李斯特菌菌液(50 CFU/mL~107CFU/mL),置于37 ℃下反应1 h。反应完成后,磁分离用PBST洗三次,分别加入100 μL辣根过氧化物酶标记的单增李斯特菌检测抗体(HRP-Ab2,5 μg/mL),37 ℃反应 1 h。磁分离用PBST洗三次,去离子水洗一次,分别加入50 μL H2O2(500 μmol/L),在 37 ℃下反应 15 min。反应完成后,取20 μL上清液加入200 μL Ag(NH3)2OH溶液(4.8 mmol/L)和100 μL Au-Fe3O4溶液(稀释100倍)混合液中,在室温下反应10 min。反应完成后,将反应液进行横向弛豫时间(T2)的测定。

1.8 实际样品检测

取10 g火腿样品切碎后与90 mL无菌生理盐水(0.9% NaCl)混合,然后以中速均质15 min。在900 μL匀浆中加入不同浓度的单增李斯特菌,振荡混匀,使其终浓度分别达到102、104、106CFU/g。配制的加标样品以500 r/min低速离心30 s,以去除大颗粒食品颗粒,并对上清液通过本方法进行分析。此外,在本地超市中购买15个火腿盲样,取10 g火腿样品切碎后与90 mL无菌生理盐水(0.9% NaCl)混合。均质15 min后,在37 ℃下震荡培养6 h。增菌后,低速离心得到上清液,通过所构建的Ag@Au-Fe3O4-MRS传感器对其进行检测。每个样品设置三个平行。

1.9 数据处理

数据采用Microsoft Excel、Origin软件进行分析处理。

2 结果与讨论

2.1 Au-Fe3O4纳米磁探针的表征

本研究首先合成了Au-Fe3O4纳米磁颗粒(图1a),并通过透射电子显微镜(TEM)对其进行了微观表征。如图1b所示,所合成的Au-Fe3O4纳米磁颗粒为双球体结构,其中黑色球体为Au纳米颗粒,经计算,其粒径约为15 nm,灰色球体为Fe3O4纳米磁颗粒,其粒径约为20 nm。整个Au-Fe3O4纳米磁颗粒的粒径约为35 nm。本研究也利用紫外分光光度计对其进行了表征(图 1c),与 Fe3O4纳米磁颗粒相比,Au-Fe3O4纳米磁探针在520 nm附近出现显著的吸收峰,与单纯的Au纳米颗粒吸收峰相同。本研究进一步对其磁响应性能进行了测定。实验结果发现,Au-Fe3O4纳米磁探针相比Fe3O4颗粒具有更好的横向弛豫效率(图1d)。同时也研究了Au-Fe3O4纳米磁颗粒的储存稳定性,在4 ℃储存720 d内,其磁信号无显著变化(图1e),且其颜色无显著变化(图 1f),证明所合成的Au-Fe3O4纳米磁探针具有良好的稳定性。综上,本研究成功合成出了磁响应性能优异的 Au-Fe3O4纳米磁探针。

2.2 Ag@Au-Fe3O4信号读出系统性能评价

本研究通过H2O2引起Au-Fe3O4磁探针状态变化来构建MRS信号读出系统(图2a)。当H2O2存在时,体系中的银离子(Ag+)能够被还原为Ag单质,沉积在 Au-Fe3O4纳米颗粒中 Au部分的表面,形成Ag@Au-Fe3O4纳米颗粒,而在银单质充足的情况下,所形成的 Ag@Au-Fe3O4纳米颗粒能够进一步组装为Fe3O4-Au@Ag@Au-Fe3O4聚集体,从而实现Au-Fe3O4磁探针从单分散状态变为聚集状态,引起T2信号的增强。H2O2含量的不同,所引起的聚集状态的变化程度不同,产生的T2信号的变化值(∆T2)也不同,从而实现对H2O2的定量分析。

本研究对 Ag@Au-Fe3O4磁颗粒所形成的聚集体进行了表征。TEM 结果显示,经组装后,Au-Fe3O4磁探针由图1b中的分散状态变为图2b的聚集状态。同时,本研究通过UV-vis对Au-Fe3O4磁探针聚集前后的紫外吸收进行了测定(图 2c)。结果显示,聚集后体系的紫外吸收峰的位置由原来的 520 nm(红色线)偏移到480 nm(蓝色线),这是由于Ag壳的包覆使Au纳米颗粒被掩盖,从而产生了蓝移。

基于上述验证结果,本研究进一步对 Ag@Au-Fe3O4信号读出系统的性能进行了评价。如图2d所示,随着HRP浓度的增加,剩余H2O2浓度降低,∆T2值逐渐减小(∆T2值=T2(H2O)-T2(H2O2))。这表明该信号读出系统对HRP具有良好的响应,可用于MRS生物传感器的开发。

2.3 Ag@Au-Fe3O4-MRS免疫传感器检测单增李斯特菌的性能评价

在上述 Ag@Au-Fe3O4磁信号读出系统可行且具有良好响应性的基础上,本研究结合免疫分析方法,构建了Ag@Au-Fe3O4-MRS免疫传感器(图3a)。当单增李斯特菌存在时,MNP180-Ab1能够对其进行捕获,进而结合HRP-Ab2,形成带有HRP的“双抗夹心”免疫复合物。HRP的量与单增李斯特菌浓度正相关。HRP能够催化H2O2降解,而剩余的H2O2能够被Ag@Au-Fe3O4信号读出系统定量分析,从而实现单增李斯特菌的检测。

2.3.1 灵敏度实验

本研究研究了Ag@Au-Fe3O4-MRS免疫传感器检测单增李斯特菌的灵敏度。实验结果显示,随着单增李斯特菌浓度的增大,∆T2值逐渐增大。经计算,本MRS传感器检测单增李斯特菌的检测限为 50 CFU/mL(图 3a),线性范围为 102CFU/mL~106CFU/mL(线性方程:Y=39.38X+1315.18,R2=0.99)(图3b)。

本研究对不同单增李斯特菌的检测方法进行了对比(表1)。与现有的基于酶联免疫吸附法(ELISA)和聚合酶链式反应(PCR)的方法相比,本 MRS传感器在灵敏、线性范围、简便性、检测成本等方面均具有较好的优势,在致病菌检测方面有良好的应用前景。

本研究中 MRS免疫传感器的高灵敏度主要归因于三方面的因素:(1)HRP-H2O2介导的信号转化系统既具有酶促反应的高效性,同时信号转化降低了基质干扰,避免了因基质引起的非特异性聚集,有助于传感器灵敏度的提高;(2)H2O2介导的Ag@Au-Fe3O4信号读出系统是一种高效的组装及信号产生策略,能够解决传统 MRS传感器聚集效率低的难题,有利于提高灵敏度;(3)所合成的Au-Fe3O4磁探针具有更强的磁弛豫效率,为灵敏度的提高提供有利的基础。

表1 单增李斯特菌的检测方法的对比Table 1 Comparison of detection methods for Listeria monocytogenes

2.3.2 特异性实验

本研究进一步测试了Ag@Au-Fe3O4-MRS免疫传感器检测单增李斯特菌的特异性。以威尔斯李斯特菌、绵羊李斯特菌、副溶血弧菌、肠炎沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为阴性对照组,验证方法的特异性。其中所有细菌的浓度均为105CFU/mL。如图4a所示,单核细胞增生李斯特氏菌 ATCC 19115和CMCC 54002的∆T2值显著高于阴性对照组,证明本MRS免疫传感器在检测单增李斯特菌时具有良好的特异性。

2.3.3 稳定性实验

本研究通过对本 MRS免疫传感器元件(MNP180-Ab1、Ab2-HRP、Au-Fe3O4)进行不同时间的储存,测试了本MRS免疫传感器的稳定性。如图4b所示,MNP180-Ab1、Ab2-HRP、Au-Fe3O4在 4 ℃储存0、3、7、10、14、21、30 d后,对单增李斯特菌(105CFU/mL)的信号响应无显著变化,证明本MRS免疫传感器的稳定性良好。

2.4 Ag@Au-Fe3O4-MRS免疫传感器检测火腿中的单增李斯特菌

实际应用性是分析方法的重要方面,为了评估本研究所构建的Ag@Au-Fe3O4-MRS免疫传感器在复杂基质中检测单增李斯特菌的实用性,本研究进行了加标回收率实验和实际样品检测实验。

2.4.1 回收率实验

表2 Ag@Au-Fe3O4-MRS免疫传感器的加标回收率Table 2 Recovery rates of Ag@Au-Fe3O4-MRS immunosensor

本研究通过在空白火腿样品中分别添加不同浓度水平(低:102CFU/g,中:104CFU/g,高:106CFU/g)的单增李斯特菌来测定本 MRS免疫传感器的加标回收率情况。如表 2所示,火腿样品中平均回收率为79.4%~105.9%,且变异系数为 6.34%~11.42%。该结果表明,Ag@Au-Fe3O4-MRS免疫传感器对复杂食品样品中的单增李斯特菌检测具有良好的抗基质干扰作用,具有较高的准确性。这是由于(1)复杂的食品样品基质中无磁信号,背景信号低;(2)本方法中磁探针的组装过程中,Au纳米颗粒起到了桥梁作用,降低了基质干扰;(3)高效的信号转化系统排除了很大部分的机制干扰。

2.4.2 实际样品检测

基于上述研究结果,本研究采用所构建的Ag@Au-Fe3O4-MRS免疫传感器和qPCR方法进行了随机火腿样品(采购自武汉当地的超市)中单增李斯特菌的检测。如图5a所示,在所检测的15个火腿样品中,样品2、3、5、10、13均检测为单增李斯特菌阳性,其他样品均检测为阴性,并且本方法与 qPCR方法检测结果具有良好的一致性(图 5b)。本研究构建的MRS免疫传感器不需要复杂的前处理和DNA提取步骤,反应体系简单,成本较低,在食源性致病菌快速检测方面具有良好的应用前景。

3 结论

本研究构建了一种快速高灵敏的 MRS免疫传感器,并将其用于单增李斯特菌的定量分析。在该传感器中,HRP-H2O2介导的信号转化系统能够有效地放大信号,并通过将单增李斯特菌的浓度信号转化为H2O2的浓度信号,降低了食品基质的干扰。而 H2O2介导的 Ag@Au-Fe3O4信号读出系统是一种高效的信号组装策略,避免了传统基质与抗体修饰磁颗粒的直接接触模式,在提高传感器灵敏度的同时,避免了磁颗粒的非特异性聚集,提高了方法的准确性。因此,本研究开发的Ag@Au-Fe3O4-MRS免疫传感器具有良好的灵敏度和准确性,在食源性致病菌检测方面具有良好的潜力。

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