基于肠道微生物研究芒针速刺对子宫内膜异位患者疼痛的治疗机理

杜 娟，丛慧芳△

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040; 2.黑龙江中医药大学附属第二医院,黑龙江 哈尔滨 150001)

子宫内膜异位症(Endometriosis，EM)是一种常见的妇科疾病，主要是指与子宫内膜类似的组织在子宫腔或肌层外的部位生长的疾病[1]。在每月的周期中，激素刺激子宫内膜异位病灶使其生长，然后分解并出血，与月经不同，这种出血仍然局限于体内部位，导致发炎、疼痛以及疤痕和粘连的形成。尽管子宫内膜异位症可能潜在地累及体内的任何器官，但其通常只影响盆腔器官，例如卵巢、输卵管和子宫韧带[2]。该病可能会影响任何年龄的患者，但在育龄妇女中最常见，对女性的健康、生活质量和生殖功能有重大影响[3]。目前，针对EM的治疗方法主要包括采取手术直接切除病灶部位或给患者使用促性腺激素释放激素激动剂阻止雌激素的释放，停止EM病灶部位出血[4]。但是，有研究显示，在手术治疗后，有大概30%～50%的患者会复发，在使用激素治疗的患者中有11%～19%的女性表示疼痛无改善，而有5%～15%的女性由于副作用而停止治疗[5]。由此可见，西医治疗EM，效果并不如人意。针刺治疗是中医常用的治疗手段之一，有研究表明，针刺具有活血化瘀的作用，与普通治疗方法联合应用能显著提高对EM的治疗效果[6]。但有关针刺治疗EM的机理还不甚清晰，因此，本研究以EM患者为治疗对象，从肠道菌群角度研究芒针治疗EM的机理，以期为其在临床上的应用提供科学支持。

1 资料与方法

1.1 一般资料

研究对象来源于2019年—2020年在本单位就诊的EM伴痛经的患者，根据中华医学会妇产科学分会子宫内膜异位症协作组《子宫内膜异位症的诊断和治疗规范》[7]诊断标准，并参照纳入和排除标准筛选出患者40例，年龄25～42岁，平均年龄33.1岁，平均病程3.7年。研究将40例患者随机分为两组，对照组和芒针组各20例。所有患者在进行治疗前均被告知具体情况，并取得了患者的自愿配合，研究全程符合相关伦理道德标准要求。各组患者基本情况见表1。各组平均年龄和病程差异均无统计学意义(P>0.05)，各组的病程分布也比较接近。

表1 两组患者基本情况比较

1.2 纳排标准

1.2.1 纳入标准 ①临床诊断已经判定为EM伴痛经的患者；②患者对此次研究知情，并同意参与研究；③患者年龄25～45岁；④血常规和肝肾指标无异常；⑤在参与研究的1个月内未接受其他中西医治疗。

1.2.2 排除标准 ①临床诊断不符合EM伴痛经症状的患者；②年龄<25岁或>45岁的患者；③处于妊娠期或者哺乳期的患者；④患有其他严重疾病的患者；⑤在参与研究的1个月内接受其他中西医治疗的患者；⑥不符合纳入标准的其他病例。

1.3 治疗方法

1.3.1 对照组 患者采取米非司酮(上海新华联制药有限公司，国药准字H10950202)给药治疗。

1.3.2 芒针组 则在给药治疗基础上，每天给予芒针速刺治疗。针刺具体选穴：关元、子宫、中极、气海、十七椎、公孙及阿是穴。具体操作方法：用碘酒对选取穴位进行消毒后，施针者用拇指先按压穴位，关元穴直刺30～50 mm，需排尿后针刺;中极、关元和气海的针感向会阴放射为佳;十七椎(在腰部，后正中线上，第5腰椎棘突下)直刺20～30 mm，进针角度沿躯体水平面与躯体矢状面成45 °夹角进针;进针时，左手拇指、食指撑开患部皮肤，针刺方向顺着进针方向由上往下低频率、小幅度捻转进针，不提插，针刺顺序为从上到下。治疗频率为1次/d，每周拔罐2次，经期疼痛时十七椎下针刺拔罐。疗程为3个月经周期，并于治疗结束后1个月经周期对患者进行随访和样品采集。

1.4 检测指标

1.4.1 患者主观疼痛评分 在治疗后的随访中，使用评分选择数字评分(NRS)法，由患者在0～10的打分表上，根据自己治疗前后疼痛情况进行打分，数字越大代表疼痛程度越重，0分为无疼痛，10分代表疼痛最剧烈[8]。

1.4.2 血清中脂多糖、前列腺素E2和雌二醇的检测 在患者治疗结束1个月经周期后，对患者进行血清样品的采集，并使用人脂多糖(LPS)ELISA检测(购自南京森贝伽生物科技有限公司)、人前列腺素E2(PGE2)ELISA检测(购自上海江莱生物科技有限公司)、人雌二醇(E2)ELISA检测(购自上海恪敏生物科技有限公司)对血清样品中的LPS浓度、PGE2浓度和E2浓度进行检测。

1.4.3 血清中炎性因子的检测 在患者治疗结束1个月经周期后，对患者进行血清样品的采集，使用ELISA试剂盒(购自上海联迈生物工程有限公司)对血清样品中的IL-1、TNF-α和IL-10的浓度进行检测。

1.4.4 粪便中微生物多样性的分析 在患者治疗结束1个月经周期后，对患者粪便进行采集，将粪便制成10 %的悬浊液后，用微生物DNA提取试剂盒(购自美国QAIGEN生物技术公司)对粪便中微生物的DNA进行提取，然后根据细菌16s rDNA的V3+V4区域的特异引物序列如下：Nobar-341F：3′CCTACGGGNGGCWGCAG 5′,Nobar-805R：3′GACTACHVGGGTATCTAATCC 5′,对扩增片段进行回收后，送北京百迈克公司进行基因测序，并对微生物的α-多样性指标进行分析，统计各试验组在97%相似度水平下的Ace、Chao1、香浓指数及辛普森指数。

1.4.5 粪便中微生物区系门水平的分析 在进行α-多样性比较的同时，将各试验组粪便微生物DNA序列中的OTU代表序列与微生物参考数据库(16S rDNA)进行比对得到各患者粪便微生物每个OTU对应的物种分类信息，进而进行物种的分类统计，获得门水平物种分布柱状图。

1.5 统计学处理

2 实验结果

2.1 两组患者NRS评分比较

治疗前对照组和芒针组患者的NRS评分比较差异无统计学意义(P>0.05);治疗后，对照组和芒针组的NRS评分均显著低于治疗前(P<0.05)，而且芒针组的NRS评分也显著低于对照组(P<0.05)。见表2。

表2 两组患者NRS评分比较

2.2 两组患者血清中脂多糖、前列腺素E2和雌二醇水平比较

在进行了3个月经周期的治疗后，与对照组相比，芒针组患者血清中的LPS、PGE2、E2浓度分别下降了23.71%、54.72%和4.16%，其中LPS、PGE2的下降达到显著水平(P<0.05)。见表3。

表3 两组患者血清中脂多糖、前列腺素E2和雌二醇水平比较

2.3 两组患者血清中炎性因子水平比较

在进行了3个月经周期的治疗后，与对照组相比，芒针组患者血清中的IL-1、TNF-α浓度分别显著下降了27.15%和12.22%(P<0.05)，血清中的IL-10则显著提高了12.35%(P<0.05)。见表4。

表4 两组患者血清中炎性因子水平比较

2.4 两组患者粪便中微生物多样性比较

在进行了3个月经周期的治疗后，与对照组相比，芒针组患者粪便中微生物α-多样性指标中的香浓指数、辛普森指数、Chao1、ACE分别显著提高了27.06%、80.77%、14.49%和23.53%(P<0.05)。见表5。

表5 两组患者粪便中α-多样性的分析结果

2.5 两组患者粪便中微生物区系门水平比较

在进行了3个月经周期的治疗后，患者粪便中微生物主要以厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)和蓝藻菌门(Cyanobacteria)为优势菌群，但两组患者在治疗后，微生物菌群的构成并不相同，与对照组相比，芒针组患者粪便微生物中的厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门和蓝藻菌门的比例显著增加(P<0.05)，而放线菌门的比例则显著降低(P<0.05)。见图1。

3 讨论

EM的临床表现为痛经、不育或卵巢肿块，年轻人的EM症状可能更为严重，尤其是在15岁之前就首次出现盆腔症状的患者。EM症状包括疲劳、精神分裂症、胃肠道问题、腹胀、恶心和在此期间出现胃部不适[9]。根据受累部位的不同，可能还会出现其他症状，例如:患有子宫内膜异位症的女性通常表现为非特异性下尿路症状[10]。通常对EM患者采取的是手术治疗方法，但该方法存在一定的风险，也有可能对育龄女性的生殖功能造成不利影响[11]。有研究认为，雌激素是影响女性EM发生和发展的因素之一，因此可以通过调控女性体内激素的方式，对患者进行治疗[12]。但是，这种方法因为是通过人为方式干预体内激素水平，对用药剂量要求比较严格，如果剂量较低治疗效果不明显，如果剂量较大副作用又会比较严重[13]。有研究指出，除了会造成患者不育或者癌变等不良影响外，EM给患者带来的困扰主要来自于病灶部位所带来的疼痛[14]。有研究发现，EM患者肠道菌群的变化与其病灶部位的疼痛程度具有相关性[15]。其主要原因是因为EM患者肠道菌群中属于变形菌门中的致病菌比例大量增加，导致进入血液中的LPS增加，进而刺激可诱导EM病灶部位出现疼痛的前列腺素E2浓度大量增加[16]。芒针疗法是中医传统的治疗方法，具有活血化瘀的治疗效果[17]。而中医认为，从病机上而言，EM属于“血瘀证”的范畴，因此适用于芒针治疗[18]。而大量临床试验也表明，芒针对EM的疼痛治疗具有良好的效果[19]。还有研究发现，芒针对肠道疾病患者的肠道微生物群具有调控作用[20]。因此，本研究推测血瘀是产生EM病灶的主要原因，而使患者病灶部位出现疼痛的原因之一就是肠道菌群发生了变化。所以，本研究用芒针速刺治疗与药物治疗相结合，检测其治疗效果，并从肠道菌群角度分析其对EM疼痛的治疗效果。之所以选择火针进行治疗是因为，芒针又称为长针，与单纯的针刺比较，芒针取穴少、针感强，可以一针透多穴，起到行气、活血和通络的作用，尤其是芒针的针尖可到达组织的深层，对人体起到了“松、顺”的效果，从而达到通则不痛的效果，因此具有极佳的镇痛作用。在本研究所选择的针刺穴位中，十七椎属于奇穴,主要作用是对痛经和子宫出血具有很好的治疗效果，气海穴可以破气血瘀滞，关元穴可以固本培益，子宫穴属于经外奇穴,与气海穴和关元穴配合具有治疗月经痛的效果，公孙穴除了具有一定的止痛作用外还具有健脾的作用，而阿是穴则远端阳性反应点具有较好的止痛作用。米非司酮是一种激素类药物，可以抑制雌激素对病灶部位的刺激，从而起到治疗的效果。通过调查发现，治疗前所有患者的NRS评分均较高，而在给予治疗后疼痛症状都有所缓解，但芒针联合药物治疗对疼痛的治疗效果要显著高于单独使用药物治疗。这说明芒针可以提高对EM患者疼痛的治疗效果，减少药物使用，进而减少药物副作用对患者造成的不良影响。而对患者治疗后血清中的LPS、PGE2和E2浓度检测发现，单独使用药物治疗的患者的LPS、PGE2显著高于芒针组，而E2水平差异却无统计学意义，这说明芒针对EM患者的雌激素水平无显著影响，但却可以下调患者体内疼痛刺激物质PGE2的浓度，这可能是因为芒针治疗的患者体内LPS水平较低。此外，有研究发现，LPS还能够造成人体内炎性因子的大量增加，进而加剧病灶部位的病变程度。本研究发现，给予芒针联合治疗后，与单独用药患者比较，促炎性因子TNG-α和IL-1的浓度显著降低，而炎症抑制因子IL-10的浓度显著增加。这说明芒针也可能通过LPS的途径减少了患者体内的炎症反应，进一步提高治疗效果。而人体内的LPS主要来源于肠道菌群中的致病菌大量繁殖，造成肠道黏膜屏障被破坏，使得大量LPS进入体内，进而对患者健康造成影响。α-多样性是衡量动物体内微生物丰度的重要指标，如果α-多样性显著下降，则说明患者体内的微生物稳态被破坏，不利于患者的健康。由于条件限制，无法直接取患者的肠道内容物进行检测，所以本研究对患者治疗后1个月经周期的粪便中微生物进行分析，通过对多样性分析发现，芒针组的α多样性要显著高于单独使用药物组，说明芒针治疗后有助于帮助患者恢复肠道稳态，促进患者肠道健康。厚壁菌门、拟杆菌门和放线菌门是动物肠道内主要益生菌所在的分类，而变形菌门中则主要是肠道的致病菌种[21]。通过对患者治疗后粪便的微生物区系研究发现，芒针组的厚壁菌门、拟杆菌门和放线菌门显著高于单独用药组，而变形菌门则显著降低。这与肠道微生物多样性相配合分析发现，芒针可以通过增加肠道内的益生菌、减少致病菌比例的方式，使肠道内环境趋于健康的稳态，减少致病菌对肠道屏障的破坏，进而减少了致病性的LPS在患者体内的扩散，从而减轻EM病灶部位疼痛给患者带来的痛苦，提高治疗效果，降低药物使用给患者带来的不良影响。

4 结论

芒针治疗是中医常用的治疗手段，具有活血化瘀的作用，与普通治疗方法联合应用能显著提高对EM的治疗效果。但有关芒针治疗EM的机理还不甚清晰，本研究以EM患者为治疗对象，从肠道菌群角度研究芒针研究治疗EM的机理后发现，配合芒针治疗后，患者的疼痛指数显著降低，这可能是因为芒针对EM患者肠道微生物的多样性和组成结构具有显著改善作用，降低了患者血清中的脂多糖、前列腺素E2和炎性因子水平，从而提高了治疗效果。