电针颈夹脊穴对神经根型颈椎病神经病理性疼痛模型大鼠脊髓背角GFAP、NF-κB及炎性细胞因子表达的影响

杨 松，孟 灵，钟青华，蒋学余

(1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410000；2.岳阳市中医医院，湖南 岳阳 414000)

神经根型颈椎病(CSR)是由脊神经根受压或刺激引起的常见的神经系统疾病[1]。它的临床特征通常是颈部、手臂疼痛和麻木，常伴有颈部运动受限[2]。CSR所致神经根性疼痛属于神经病理性疼痛范畴[3]。据报道，CSR的发病率正在逐年上升，且发病趋年轻化，严重影响着患者的身体健康与生活质量[4]。治疗上包括手术治疗和非手术治疗。由于手术治疗的不良并发症和术后复发是不可预测的，故非手术治疗是大多数患者的首选[5]。针灸疗法作为非手术治疗的主要干预手段，其临床疗效不亚于手术治疗，但其作用机制复杂[6]。故本实验通过观察电针颈夹脊穴对CSR所致神经病理性疼痛模型大鼠脊髓背角GFAP、NF-κB及炎性细胞因子表达的影响，探讨电针颈夹脊穴治疗CSR所致神经病理性疼痛的可能镇痛机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

清洁级成年健康雄性SD大鼠60只[上海斯莱克实验动物有限公司提供，动物许可证号：SYXK(沪)2017-0002]，体质量(270±20)g。饲养环境的温度(25±0.5)℃，湿度(60±2.5)%。实验动物饲喂相同的饲料，适应性喂养7 d后，将60只大鼠随机分为空白组、假手术组、模型组、电针组和LAA组，每组12只。本实验已通过湖南中医药大学动物实验福利伦理会审查批准(批准号：SLBH-201910140006)。

1.2 主要试剂及仪器

1.2.1 试剂 水合氯醛、多聚甲醛(国药试剂)；青霉素(杭州吉诺)；NF-κB抗体、GFAP抗体(Abcam)；lexa Fluor 488标记山羊抗小鼠IgG和Alexa Fluor 488标记山羊抗兔IgG、Alexa Fluor 555标记驴抗小鼠IgG、Alexa Fluor 555标记驴抗兔IgG(上海碧云天)；Trizol Reagent(INVITROGEN)；PCR反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒(Takara)。

1.2.2 仪器 荧光定量PCR仪96lightcycler(Roche)；一次性无菌针灸针(0.35 mm×25 mm)、华佗牌SDZ-Ⅱ型电子治疗仪(苏州医疗用品厂有限公司)；超低温冰箱(Sanyo)；冰冻切片机、激光共聚焦显微镜(Leica)；高速低温离心机(Eppendorf)。

1.3 模型制备与鞘内置管

除空白组外，其余大鼠均腹腔注射10%水合氯醛溶液(0.35 mL/100 g)进行麻醉，然后置于俯卧位进行固定，以T2棘突为标记，沿着大鼠后正中线做正中切口，钝性分离颈后组织至C6～7暴露，咬除左侧C6～7关节突与C6横突部分，显露出左侧C6～7脊神经，用4-0线结扎C7背根神经节远端神经根，在倒置显微镜下观察神经表面动脉受压情况，结扎松紧度以有血流通过为宜。假手术组只暴露神经根而不结扎，余同模型组。然后进行鞘内置管操作。咬除颈椎棘突，打开椎板，撕开硬脑膜。经小脑延髓池将PE-10管插入蛛网膜下腔，直至腰膨大，缓慢注入10 mL生理盐水，防止血凝块堵塞开口。然后将管外口封闭，将暴露于皮外的PE-10管固定在颈部，关闭术口，缝合。连续3 d腹腔注射青霉素20万U，防止术后切口感染。术后第5天参照文献[7]所述方法对大鼠进行步态评分，步态评分2～3分并出现自噬、舔咬和嘶叫等行为者即为造模成功。

1.4 干预方式

1.4.1 空白组 正常饲养，不做其他任何干预。

1.4.2 假手术组 术后第7天开始,同电针组进行捆绑干预，20 min/次，1次/d，连续干预14 d。

1.4.3 模型组 术后第7天开始。同电针组进行捆绑干预，20 min/次，1次/d，连续干预14 d。

1.4.4 电针组 术后第7天开始电针干预。将大鼠俯卧位捆绑于鼠板上，参考大鼠穴位图谱[8]，取双侧C6～7颈夹脊穴，直刺进针，深度：0.3～0.6 cm，轻度捻转提插后，以单侧C6～7为1组，两侧均通过针柄连接电子针疗仪，疏密波，20 min/次，1次/d，连续干预14 d。

1.4.5 LAA组 术后第7天开始同电针组进行捆绑，鞘内注射星形胶质细胞抑制剂L-α-氨基己二酸(LAA)干预，5 nmoL/次，1次/d，连续干预14 d。

1.5 免疫荧光法观察脊髓背角NF-κB、GFAP表达

干预完成1 d后，每组取6只大鼠腹腔注射过量10%水合氯醛处死。参照杜俊英等[9]的脊髓提取方法，快速提取出脊髓C6～7节段，取左侧脊髓背角，转移至4%多聚甲醛4 ℃固定6 h，再转移至20%和30%蔗糖溶液中进行梯度脱水。在液氮中速冻，储存在-80 ℃冰箱中。冰冻切片机切片。用组化笔在玻片上圈起组织， PBS浸润，多聚甲醛固定，PBS漂洗，0.5 %Txiton X-100处理，TBST漂洗，封闭，加入NF-κB一抗或GFAP一抗(用0.1 BSA/TBST配)，4 ℃孵育过夜；0.1 %BSA/TBST漂洗；加入相应的荧光素标记的第二抗体(用含0.1 %BSA的TBST配)，室温孵育2 h，0.1 %BSA/TBST漂洗，DAPI细胞核染色，PBS漂洗，封片。所制切片于激光共聚焦显微镜400倍下观察并拍照取样。采用Image J软件对摄片进行分析测量荧光强度。

1.6 Real-time PCR法观察脊髓背角炎性细胞因子IL-1β、IL-6、IL-18及TNF-α mRNA表达

干预完成1 d后，每组取6只大鼠腹腔注射过量10%水合氯醛处死。快速提取出脊髓C6～7节段，取左侧脊髓背角用于总RNA的提取，按PCR反转录试剂盒操作程序进行cDNA合成，在冰上PCR管中制备PCR反应混合液，混匀后置于荧光定量PCR仪上进行PCR扩增，每个样品做3个重复对照。通过2-ΔΔCt法进行相对表达量计算。

1.7 统计学处理

本实验所得数据均通过SPSS 25.0软件进行处理。因各组间数据均满足正态性且方差齐性，故采用单因素方差分析检验比较NF-κB、GFAP以及炎性细胞因子IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α mRNA在空白组、假手术组、模型组、电针组与LAA组的表达情况，采用LSD检验比较各组间NF-κB、GFAP以及炎性细胞因子IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α mRNA表达。

2 结果

2.1 各组大鼠脊髓背角NF-κB表达比较

假手术组大鼠脊髓背角有少量NF-κB表达。空白组与假手术组大鼠脊髓背角NF-κB差异无统计学意义(P>0.05)。与假手术组比较，模型组大鼠脊髓背角NF-κB免疫荧光强度明显增强(P<0.05)。与模型组比较，电针颈夹脊穴和鞘内注射LAA均可显著降低脊髓背角NF-κB的表达(P<0.05)。电针组与LAA组之间脊髓背角NF-κB的表达差异有统计学意义(P<0.05)。见表1、图1。

表1 各组大鼠脊髓背角GFAP 、NF-κB平均荧光强度比较

2.2 各组大鼠脊髓背角GFAP表达比较

GFAP作为星形胶质细胞活化的标志，在空白组和假手术组的大鼠脊髓背角中都有轻微表达。空白组与假手术组大鼠脊髓背角GFAP差异无统计学意义(P>0.05)。与假手术组比较，模型组脊髓背角GFAP免疫荧光强度显著增强(P<0.05)。电针组与LAA组脊髓背角GFAP表达均明显低于模型组(P<0.05)。电针组与LAA组之间脊髓背角GFAP的表达差异有统计学意义(P<0.05)。见表1、图2。

2.3 各组大鼠脊髓背角IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α mRNA表达比较

空白组与假手术组大鼠脊髓背角IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α mRNA的表达差异无统计学意义(P>0.05)。模型组大鼠脊髓背角炎性细胞因子IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α mRNA的表达明显高于假手术组(P<0.05)。与模型组比较，电针颈夹脊穴和鞘内注射LAA均能降低大鼠脊髓背角IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α mRNA表达(P<0.05)。电针组与LAA组大鼠脊髓背角IL-1β、IL-6、IL-18 mRNA表达差异有统计学意义(P<0.05)，TNF-α mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)。见表2、图3。

表2 各组大鼠脊髓背角IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α mRNA表达比较

3 讨论

现代医学认为CSR是因颈椎关节、颈椎间盘或韧带等急慢性损伤所致的退行性疾病，发病机理主要与神经根受机械压迫和炎性刺激有关[10]。神经根的炎性损伤是导致该病的主要病理基础，所致根性疼痛属神经病理性疼痛。CSR属于中医学“痹证”范畴，主要病机是风寒湿三邪留滞经络，气血瘀滞不通。《素问·举痛论》云:“经脉流行不止、环周不休，寒气入经而稽迟……客于脉中则气不通，故卒然而痛”，表明人体气血之气循经络周流全身，循环不止，寒邪侵袭经络致脉气不通，脉中气血瘀滞不行，可发疼痛。《医宗必读·心腹诸痛》云:“治痛……有以通则不痛，痛则不通者”，有气血通畅、疼痛自解之意。针刺疗法可疏通经络、调和气血和扶正祛邪以达“通则不痛”之效[11]。现代医学研究也表明针刺治疗CSR病理性疼痛有一定的镇痛作用，但其镇痛机制复杂[12-13]。研究表明，针刺可调控炎性细胞因子和炎性信号通路的表达[14]。本实验通过观察电针颈夹脊穴对CSR所致神经病理性疼痛模型大鼠脊髓背角GFAP、NF-κB及炎性细胞因子表达的影响，结果提示电针可抑制星形胶质细胞激活，下调NF-κB、IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α表达，减轻神经根压迫所致炎性反应对神经根的损伤。

本研究所选颈夹脊穴位于膀胱经与督脉之间，督脉为“阳脉之海”，可调节十二经脉之气血，膀胱经为卫气之始发，卫阳之最盛，可宣发卫气以抗邪。夹脊穴内夹督脉，外循膀胱，沟通督脉和太阳经气，针之可通调气血、平衡阴阳。从现代医学而言，夹脊穴深处有脊神经分布，脊神经前后根分别负责人体运动性与感觉性，通过刺激夹脊穴可影响脊神经前后根的传导，进而调节肢体的运动和感觉功能[15]。夹脊穴可应用于治疗疼痛相关疾病。既往研究表明刺激夹脊穴可通过调控疼痛相关蛋白基因的表达以达镇痛作用[16]。本研究所选用电针疗法是经络学说和神经电生理结合的产物，在针刺颈夹脊得气后加入电刺激可增强镇痛疗效。夹脊穴搭配电针可使肌肉出现节律性的放松与收缩，并能兴奋并调节脊神经和交感神经功能，改善局部血液循环，抑制疼痛信号传递，进而恢复机体正常生理状态[17]。

研究表明，脊髓背角胶质细胞与周围神经损伤引起的神经病理性疼痛联系密切[18]。胶质细胞受神经损伤、感染等刺激后，被激活并分泌大量炎性介质，触发中枢神经网络系统的神经细胞免疫应答，引起中枢敏化，导致疼痛阈值降低，并促进神经病理性疼痛的形成[19]。通过本研究发现经造模处理后，模型大鼠脊髓背角星形胶质细胞标志物GFAP的含量较假手术组明显升高，表明造模成功后，星形胶质细胞表达较无损状态高，其表达强度与周围神经损伤密切相关。本研究结果还发现电针颈夹脊与鞘内注射LAA均可降低脊髓背角GFAP的含量，但降低程度电针颈夹脊较鞘内注射LAA为低，表明电针颈夹脊可以降低星形胶质细胞的表达，从而改善脊神经受损情况。

本研究还发现造模后大鼠脊髓背角NF-κB的含量明显升高。NF-κB作为一种重要的核转录因子，可参与调节控制炎症基因各组相关基因的表达[20]。在非活性状态下，NF-κB受IκB的约束，通常位于细胞质中，当NF-κB被各种刺激激活后，可导致IκB磷酸化，NF-κB失去约束并转位至细胞核内，从而参与到调节控制各种炎性细胞因子的表达，增加炎性细胞因子的产生和释放，且炎性细胞因子可再次激活NF-κB，进一步形成炎症级联反应，推进机体疼痛的发生[21]。本研究结果发现鞘内注射LAA可降低脊髓背角NF-κB的表达，表明抑制星形胶质细胞的表达可使脊髓背角NF-κB的表达同时降低，两者之间可能具有一定联系。与此同时电针颈夹脊穴亦可降低脊髓背角NF-κB的表达，但其降低NF-κB表达程度较鞘内注射LAA低。

既往研究表明，脊髓内炎性细胞因子的表达与神经病理性疼痛密切相关，且周围组织中促炎细胞因子的变化在缓解疼痛方面也起着至关重要的作用[22-23]。由活化的巨噬细胞产生的IL-1β对外周或中枢神经系统具有疼痛诱导作用，在炎症反应中NF-κB被激活时其活性会上调[24-25]。IL-1β可诱导多种炎性细胞因子的表达，如IL-6、IL-18和TNF-α等，其表达程度可影响和放大脊髓对有害刺激的感知，最终导致痛觉过敏[26-27]。IL-6和IL-18作为具有广泛生物学效应的炎性细胞因子，参与了周围神经损伤引起的神经性疼痛的发生，在各种神经病理性疼痛模型中均提示IL-6和IL-18在脊髓或背根神经节中的表达升高，且通过鞘内注射IL-6、IL-18可引起类似于神经损伤后的疼痛过程，鞘内注射抗IL-6中和抗体可减轻这些疼痛相关行为，且IL-18还可通过调节其他炎性细胞因子如TNF-α、IL-6和IL-1β的活性，参与到神经病理性疼痛的发生发展过程中[28-29]。通过研究发现，机体内神经元细胞和胶质细胞可通过分泌TNF-α参与神经病理性疼痛的调节, TNF-α亦被认为可能成为治疗神经病理性疼痛的一个良好靶标[30]。根据当前研究现状，神经胶质细胞、NF-κB与炎性细胞因子与神经病理性疼痛密切相关，可参与介导神经病理性疼痛的发生发展过程，这也为靶向治疗神经病理性疼痛提供了可靠的理论依据。本研究也发现经造模处理后，大鼠脊髓背角IL-6、IL-18、IL-1β及TNF-α表达均上升，证实了炎性因子的表达与神经病理性疼痛的密切相关性。实验结果还发现经过鞘内注射LAA干预后，大鼠脊髓背角IL-6、IL-18、IL-1β及TNF-α表达降低，表明降低星形胶质细胞表达后，可引起炎性因子的表达，星形胶质细胞可能是神经胶质细胞、NF-κB与炎性细胞因子三者反应的起始作用点。与此同时电针颈夹脊也可使大鼠脊髓背角IL-6、IL-18、IL-1β及TNF-α表达降低，在降低大鼠脊髓背角IL-6、IL-18及IL-1β表达上较LAA低，但在降低TNF-α表达上同鞘内注射LAA差异无统计学意义。

综上所述，电针颈夹脊穴可能通过抑制星形胶质细胞活化，下调NF-κB、IL-1β、IL-6、IL-18及TNF-α的表达，减轻神经根压迫所致炎性反应，从而改善CSR所致神经病理性疼痛症状。