复方菊花总黄酮大孔树脂纯化工艺研究*

周衡朴 任敏霞 吴素香 石森林

浙江中医药大学药学院 浙江 杭州 310053

复方菊花以临床经验方为依据，由杭白菊和红花等配伍组成，具有预防和治疗视疲劳的作用[1，2]，黄酮是其中的主要有效组分。但复方提取物黄酮类成分含量低，服用剂量大，因此，需要对复方中的黄酮类成分进行富集纯化。本文采用大孔吸附树脂法对复方菊花总黄酮进行纯化富集，并筛选出了最佳纯化工艺，为复方菊花总黄酮的分离纯化提供了实验依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器：JA2003N电子天平（上海精密仪器有限公司）；XS105分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；RE-3000旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器有限公司）；UV-2450紫外可见分光光度计（日本SHIMADZU公司）；DZF6050型真空干燥箱（上海顿克仪器科技有限公司）；Avznti J-26 XP贝克曼离心机（贝克曼库尔特商贸有限公司）；METTLER TOLEDO pH计（梅特勒-托利多仪器有限公司）。

1.2 试剂：杭白菊、红花（浙江中医药大学中药饮片有限公司，批号：190301，181201，经鉴定为菊科植物菊Chrysanthemum morifoliumRamat.的干燥头状花序，菊科植物红花Carthamus tinctoriusL.的干燥花）；芦丁（纯度98.00%，成都曼思特生物科技有限公司，批号：MUST-19010202）；HPD600，LSA-10（郑州和成新材料科技有限公司）；磷酸、甲醇、乙腈为色谱纯（美国TFDIA公司）；其他试剂均为分析纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 复方菊花浸膏中总黄酮的含量测定：具体如下。

2.1.1 对照品溶液的配制：精确称取芦丁对照品1.18mg，置于10ml容量瓶中，用70%乙醇溶解并稀释至刻度，即得浓度为0.118mg·ml-1的芦丁对照品溶液。

2.1.2 标准曲线的绘制：精密量取芦丁对照品溶液0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、3.0ml，分别置 10ml量瓶中，加10%氯化铝溶液2ml，0.1mol·L-1醋酸钾溶液3ml，加入70%乙醇至10ml，摇匀，放置15min。同法以对照品溶液吸取0ml配制成的10ml溶液作为空白，采用分光光度法在403nm波长处测定吸光度，以芦丁浓度x（µg·ml-1）为横坐标，吸光度y为纵坐标，进行线性回归，回归方程：y=0.0278x+0.0001，r=0.9997，表明芦丁在5.90～35.40µg·ml-1范围内线性关系良好。

2.1.3 总黄酮含量测定：取干浸膏约0.12g，精密称定，置50ml量瓶中，用70%乙醇溶解并定容至刻度，摇匀，精密量取0.25ml（或直接精密量取洗脱液0.25ml），置于10ml容量瓶中，加入10%氯化铝溶液2ml，0.1mol·L-1醋酸钾溶液3ml，加入70%乙醇至10ml，摇匀，放置15min后在403nm波长处测定吸光度，根据芦丁标准曲线计算总黄酮含量。

2.2 上样液的制备：称取处方药材40%醇提取物配制成0.2g·ml-1生药的上样液。

2.3 静态吸附试验：称取经预处理后的6种大孔树脂各4g，置100ml具塞锥形瓶中，加入上样液20ml，置恒温振荡器中（100r·min-1，37℃）震荡24h，过滤，分别测定上样液及滤液中总黄酮的含量，计算吸附率和洗脱率。结果：HPD600、H1020、LSA-10、LS206四种大孔树脂具有较好的洗脱能力和吸附能力。

2.4 动态吸附试验：称取 HPD600、H1020、LSA-10、LS206四种大孔树脂各10g，湿法装柱，以2BV·h-1速度上样20ml，先用5BV超纯水以2BV·h-1速度冲洗，再用5BV 60%乙醇以2BV·h-1速度洗脱，收集洗脱液，测定总黄酮含量，计算比吸附量、吸附率、比洗脱量、洗脱率。结果：LS206型大孔树脂吸附和洗脱性能较好，可达99.30±0.02%、70.90±1.19%。

2.5 LS206型大孔树脂的纯化工艺考察：具体如下。

2.5.1 上样量及上样速度考察：将LS206树脂湿法装柱（径高比1∶3），上样液（总黄酮浓度为11.69mg·ml-1）分别以1BV·h-1、2BV·h-1、3BV·h-1各上样120ml（约2BV），每份10ml收集流出液，测定总黄酮含量，并绘制泄漏曲线，见图1。当流出液中目标产物的泄漏量达到上样浓度的10%，视为吸附终点。由图可知，当上样速度为1BV·h-1时，第12份流出液出现明显的泄漏；当上样速度为2BV·h-1、3BV·h-1时，第9份流出液中总黄酮浓度超过上样浓度的10%，出现明显的泄漏。考虑效率及时间成本，最终选择上样量为80ml（约1.3BV），上样速度为2BV·h-1。

2.5.2 径高比考察：将LS206树脂以1∶3、1∶5、1∶7径高比湿法装柱，以2BV·h-1速度分别上样80ml、133ml、187ml（约1.3BV）上样液，分别用2BV超纯水以2BV·h-1速度除杂，用3BV 60%乙醇以2BV·h-1速度洗脱，收集洗脱液，测定总黄酮含量，并进行真空干燥，计算总黄酮的浸膏得率、纯度。结果显示，径高比为1∶3～1∶7时，总黄酮的转移率均在80%以上，且径高比为1∶5得到的总黄酮纯度最高，可达(84.40±2.80)%。因此，选择径高比为1∶5。

2.5.3 除杂溶剂的选择：将LS206树脂以1∶5径高比湿法装柱，以 2BV·h-1速度上样 133ml（约 1.3BV），以2BV·h-1速度分别用2BV的超纯水、10%乙醇、0.1mol·L-1NaCl溶液、0.1mol·L-1HCl溶液、0.1mol·L-1NaOH溶液除杂，收集除杂流出液，测定总黄酮的含量，取50ml除杂流出液真空干燥并计算固化物的重量，结果见表1。由结果可知，用0.1mol·L-1NaCl溶液和0.1mol·L-1HCl溶液除杂时，总黄酮损失率最低，但NaCl溶液在工业生产中使用方便，环境友好，因此选择0.1mol·L-1NaCl溶液作为除杂溶剂。

表1 不同除杂溶剂下固化物重及总黄酮损失率（±s，n=3）

表1 不同除杂溶剂下固化物重及总黄酮损失率（±s，n=3）

除杂固化物中杂质含量（%）94.60±0.05 91.93±0.04 98.48±0.01 99.81±0.01 83.78±0.26除杂溶剂超纯水10%乙醇0.1mol·L-1NaCl溶液0.1mol·L-1HCl溶液0.1mol·L-1NaOH溶液总固化物重（g）4.77±0.01 5.52±0.07 5.78±0.07 4.78±0.24 6.83±0.04总黄酮损失率（%）16.57±0.18 28.65±0.46 5.66±0.06 0.60±0.04 71.27±1.53

2.5.4 除杂溶剂用量考察：将LS206树脂以1∶5径高比湿法装柱，以 2BV·h-1速度上样 133ml（约 1.3BV），以0.1mol·L-1NaCl溶液为除杂溶剂，每份20ml收集流出液，真空干燥，称重，测定总黄酮含量，结果见表2。由结果可知，0.1mol·L-1NaCl溶液用量达100ml后，固化物的增重趋缓，而固化物中总黄酮的含量大幅增加，因此选择0.9BV的0.1mol·L-1NaCl溶液除杂。

表2 除杂流出液固化物重量及固化物中总黄酮含量（±s，n=3）

表2 除杂流出液固化物重量及固化物中总黄酮含量（±s，n=3）

固化物中总黄酮含量（%）0.144±0.005 0.261±0.006 0.417±0.025 0.664±0.007 1.012±0.011 1.837±0.061 2.284±0.032 2.585±0.011 2.678±0.037 2.664±0.079序号1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0固化物重量（g）1.253±0.008 1.231±0.013 1.054±0.006 0.610±0.030 0.357±0.031 0.254±0.006 0.197±0.007 0.184±0.004 0.174±0.004 0.159±0.004固化物中总黄酮总量（g）0.002±0.000 0.003±0.000 0.004±0.000 0.004±0.000 0.004±0.000 0.005±0.000 0.004±0.000 0.005±0.000 0.005±0.000 0.004±0.000

2.5.5 洗脱溶剂及用量考察：将LS206树脂以1∶5径高比湿法装柱，以2BV·h-1速度上样133ml（约1.3BV），用0.9BV的0.1mol·L-1NaCl溶液以2BV·h-1速度除杂，分别用40%、60%、80%乙醇为洗脱溶剂以2BV·h-1速度洗脱，每20ml收集一份洗脱液，测定总黄酮的含量，真空干燥，测定浸膏纯度，结果见表3。由结果可知，乙醇浓度越高，洗脱速度越快，但80%乙醇总黄酮的洗脱量比60%乙醇少，因此，选择60%乙醇为洗脱溶剂。第1、2个流份中，杂质含量过高，第14个流份中总黄酮含量很低，且前13个流份总黄酮含量约占上样液的95%，因此选择2.5BV 60%的乙醇洗脱。

表3 总黄酮洗脱量及纯度（±s，n=3）

表3 总黄酮洗脱量及纯度（±s，n=3）

流份 总黄酮洗脱量（mg） 浸膏中总黄酮纯度（%）1 2 3 4 567 8 9 1 0 11 12 13 14 15 40%乙醇7.76±0.45 8.52±0.21 62.54±1.66 334.67±1.03 344.27±11.70 217.04±1.19 122.30±5.78 81.04±4.28 59.77±0.91 39.43±1.43 30.66±1.04 16.49±0.67 13.66±0.13 10.61±0.19 7.29±0.08 60%乙醇5.90±0.20 7.25±0.21 70.29±1.36 462.13±20.74 427.80±9.17 223.90±8.67 124.40±1.80 66.71±0.96 35.85±1.21 22.95±0.46 23.41±0.31 12.66±0.08 5.54±0.05 3.78±0.16 2.66±0.11 80%乙醇3.84±0.15 8.37±0.27 46.14±1.16 47.38±1.85 48.90±0.42 49.52±0.73 51.08±1.63 51.55±0.72 51.91±0.34 51.56±0.76 43.47±1.69 29.52±1.57 22.76±1.65 21.45±1.60 17.78±0.53 80%乙醇9.50±0.29 21.61±0.40 345.13±9.29 481.47±12.34 271.47±23.16 112.23±1.01 58.89±0.81 32.83±1.33 15.75±0.31 8.59±0.17 5.36±0.16 3.04±0.01 1.97±0.10 1.35±0.03 0.89±0.03 40%乙醇3.23±0.04 4.39±0.14 24.12±0.62 51.04±1.24 52.45±1.04 55.89±0.49 58.52±0.28 64.14±2.77 64.50±0.59 64.63±0.67 60.52±0.98 44.58±1.25 44.08±0.42 43.04±1.40 36.43±0.39 60%乙醇2.26±0.07 3.71±0.06 23.61±0.41 50.72±1.36 52.56±0.90 52.63±0.65 53.14±1.64 53.51±0.68 56.60±1.62 58.34±0.32 78.04±1.02 62.28±1.85 40.55±1.52 37.76±1.56 36.29±1.41

2.6 复方菊花中总黄酮的纯化：将LS206树脂以1∶5径高比湿法装柱，以2BV·h-1速度上样1.3BV上样液，用0.9BV的0.1mol·L-1NaCl溶液以2BV·h-1速度除杂，用2.5BV 60%乙醇以2BV·h-1速度洗脱。弃去前0.6BV洗脱液，收集后续洗脱液，回收乙醇，真空干燥得干浸膏，测定总黄酮的含量，计算转移率和纯度，结果见表4。由结果可知，大孔树脂纯化后总黄酮的纯度达60%左右，纯化过程的转移率为80%左右，纯化效果较好。

表4 LS206大孔树脂纯化复方菊花总黄酮（n=3）

3 分析与讨论

本实验采用静态和动态吸附实验，对六种大孔树脂进行筛选，最终选择了LS206型大孔树脂。由于大孔树脂对乙醇溶液的吸附能力较差，故上样液需旋蒸至无醇味，但这会导致上样液中有部分物质沉淀下来，故需要离心取上清液作为上样液。细小颗粒的大孔树脂会使分离柱的流速变慢甚至液体不能流出，而将细小颗粒的大孔树脂筛去，流速能调整到2BV·h-1。另外，再生后的大孔树脂保存在纯化水中易发霉，故需及时更换纯化水。上样液pH4～5时，LS206大孔树脂对总黄酮的吸附能力和洗脱能力较强，而提取液本身pH在4～5之间，故不需要调节提取液的pH。纯化过程中，目前普遍采用纯水或低浓度乙醇进行除杂，本实验考察了不同的除杂溶剂，发现用NaCl溶液除杂时，总黄酮损失率比用纯水和低浓度乙醇除杂时更低，具有一定的创新性。考察了分段收集的洗脱液，发现前0.6BV洗脱液中杂质含量过多，导致洗脱液整体纯度较低。弃去前0.6BV的洗脱液，有效提高了总黄酮纯度。