二草清肝汤抑制LPS引起肝损伤的TLR4及其下游信号分子表达*

万 苗 欧阳钦 吴春明 刘三海 赵安静

浙江中医药大学附属温州中医院 浙江 温州 325000

已故浙南地区名老中医任侠民先生以温州地道药材——鸡骨柴和平地木，创立“鸡平合剂”[1]，临床证实对急性肝衰竭（ALF）有一定的疗效；结合《内经》《伤寒论》有关“黄疸”论述，以“湿蕴热郁、不得越发”为病机，创制二草清肝和剂（ercao qinggan decoction，EQD），临床研究证实EQD能降低免疫性肝损害大鼠的肝损伤，其机制与肝细胞内的Toll样受体4（TLR4）及其下游信号分子受抑制不无关系[2，3]。本研究旨在通过构建ALF模型，从分子和细胞水平研究TLR4通路中相关信号分子在肝损伤及肝损伤修复过程中的表达水平，探讨EQD对该通路的影响机制。

1 材料与方法

1.1 动物：雌性小鼠21只，BALB/C型，SPF级，体重18～20g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK（湘）2019-0004，遵伦理要求进行动物实验。

1.2 药物：鸡骨草、垂盆草、茵陈各15g，制大黄3g，茯苓、泽泻、苍术各10g，陈皮、甘草各6g，以上中药均来自温州永安堂中药饮片公司，按常规剂量使用，水煎2次后药液合并、过滤并浓缩，两种浓度生药含量分别为3.3g/ml、6.6g/ml。

1.3 实验分组：随机分4组：EQD小剂量组（n=6），EQD大剂量组（n=5），空白对照组（n=3），内毒素模型组（n=7），适应性饲养7天。

1.4 模型验证：取6只正常BALB/C小鼠随机分成内毒素脂多糖（LPS）高（15mg/kg）、中（10mg/kg）、低(5mg/kg)剂量组，每组2只，另外取1只作为空白对照组。高中低剂量组依次按1.5mg/ml、1.0mg/ml、0.5mg/ml剂量的LPS联合80mg/ml D-氨基半乳糖（D-GalN）的混合药液（1ml/100g）进行腹腔注射，观察24h。结果，高剂量组小鼠全部死亡，中剂量组小鼠死亡1只，中剂量组存活1只和低剂量组的2只均状态不佳。存活小鼠处死后取出肝脏称重，HE染色观察病理改变。HE结果显示LPS中剂量组模型成功，LPS低剂量组1只成模1只未成模。根据模型验证的结果选用LPS10mg/kg和7.5mg/kg两个剂量做毒性实验，前述剂量造模死亡率达80%，后述剂量造模死亡率是14%，故选用7.5mg/kg的LPS剂量造模。

1.5 实验方法：①EQD高、低剂量组分别予生药含量6.6g/ml、3.3g/ml的EQD溶液每只3ml/kg灌胃，每日1次，连续12天；②空白对照组和内毒素模型组给予每只3ml/kg的生理盐水灌胃12天，每日1次；③末次灌胃4h后，除空白对照组外，其余所有小鼠均腹腔注射LPS和D-GalN混合液进行造模。④造模24h后处死所有小鼠，并剖取肝标本称重，加入10%福尔马林液固定组织。

1.6 HE染色：取组织流水冲洗，乙醇脱水3次，进行石蜡渗透包埋，显微切片组织处理、温水浴，然后脱胶、水化。苏木素染色3min，盐酸乙醇分化液进行可选区分化15s，稍水洗，将玻片暴露在pH值为碱性的发蓝溶液中返蓝15s，流水冲洗，伊红染色3min；流水冲洗，酒精漂洗、脱水，盖玻片封片，镜检。

1.7 免疫组化：切片脱蜡，水化；抗原修复应用在柠檬酸缓冲液（pH6.0）中使用压力锅的热诱导方法。切片放在孵育盒中，加入3% H2O2；IxPBS缓冲液（PBS）洗涤，5% BSA切片封闭；PBS中再次洗涤，一抗 TLR4（1∶200）4℃孵育过夜。PBS液洗涤，二抗辣根酶标记山羊抗兔IgG(H+L)（1∶100）37℃孵育30min；PBS淋洗完全后用DAB显色剂处理载玻片，然后复染、脱水和封固。

1.8 荧光定量PCR检测：①逆转录：在RNase-free的离心管中加入Total RNA 1pg-1μg、4×gDNA wiper Mix 4μl、RNase-free ddH2O 16μl配制混合液，42℃下进行去除基因组DNA。加入5×HiScriptⅡ qRT SuperMixⅡ 4μl，移液器吹打混匀；再将离心管小心正确置入干式电加热器中，50℃15min，而后换到85℃条件下持续5s，以进行逆转录反应过程。②组织样品处理及RNA提取：剪取50mg组织样品置于用液氮预冷的研磨器中研磨成细粉置于离心管内，将细粉立即与1ml的TRlzon Reagent裂解缓冲液混合，标记好冷藏于-20℃防止被降解。上述离心管内加入氯仿(1∶1)，倒置1～2min混合均匀；然后将离心管放置4℃下，12000rpm低温高速离心机（离心半径9cm，离心半径、温度、转数下同）离心15min，收集无色上水相层于新的预冷1.5ml RNase-Free离心管中，加入70%乙醇混匀，离心30s弃流出液；依次加入700μl RW1、500μl RW2、500μl RW2三次洗涤沉淀并均离心30s后弃流出液；冰盒上放置5min，干燥后将RNA颗粒装入预冷的1.5ml RNase-Free离心管中，加入35μl无RNase水重新溶解，-80℃条件下保存。使用紫外分光光度仪在OD260和OD280下测定、计算数据。③荧光定量PCR：TLR4、核转录因子κB（NF-κB）、β肌动蛋白（β-actin）的引物序列及长度、产物长度、退火温度见表1；常规三步法反应程序，三步法：变形95℃10s，退火30s，延伸30s，以上三步循环40次。

表1 PCR引物序列、引物长度、产物长度及退火温度

1.9 Western Blot（WB）检测：取50mg组织样品，加入细胞裂解缓冲液混合，使颗粒破碎，涡旋样品放置20s，在冰上孵化20min，保持每5min钟旋转一次样品。然后在4℃下放置15min后，吸取上清液以获得蛋白质裂解产物，丢弃颗粒沉淀。蛋白质裂解产物应始终保存在冰块上，并储存在-80℃。采用试管检测法定量检测，全自动酶标仪测定样品的吸光度，用吸光度值测定蛋白质浓度；然后创制标准曲线，计算样品的蛋白浓度。配置分离胶、浓缩胶，上样，煮沸5min蛋白变性，电泳60V压缩蛋白（30min），80V分离蛋白（60min），剪好聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，在甲醇中摇动15s激活，ddH2O冲洗。按顺序在转印盒的黑色一侧建立转印堆栈，确保所有部件都用传输缓冲器完全湿润。通过在传输堆上滚动玻璃管或吸管，确保不存在气泡。用300mA恒流传输［3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）、TLR4、NF-κB分别为1h30min、2h、1h30min］；在胭脂红染色溶液中摇动膜约30s，检查蛋白质是否已成功转移到膜上，然后PBS洗涤薄膜，然后用牛奶封闭；一抗（1∶2000）溶液孵育4℃过夜，二抗（1∶2000）溶液中孵育室温2h。在膜上滴加ECL曝光液，在凝胶成像系统中曝光。采用“ImageJ”软件分析各抗体条带灰度值。

1.10 统计学方法：PCR中各组mRNA的相对表达量数值用SPSS 19.0进行检验，P＜0.05有统计学意义；其余数据均用Graphpad Prism 7进行统计分析，表示为平均值±SD；组间的显著性差异经One-way和Two-way ANOVA分析，以P＜0.05作为显著性差异。

2 结果

2.1 动物体重和肝重：如表2示，小鼠LPS处理造模后，体重、肝重有所下降，加入EQD后体重和肝重有所上升。

表2 小鼠肝重均值多重比较分析

2.2 病理分析：空白对照组小鼠的肝小叶结构完整；肝窦散布有序、较宽，肝上皮细胞排列规整、呈多边型，胞质染色均匀，胞核清晰分明，未见明显肿胀变性，库普弗细胞分布均匀，未见周部大量聚集；内毒素模型组中巨噬细胞聚集，肝小叶结构较混乱；肝细胞脂肪沉积、水肿较前明显加重；二草清肝汤组病变则明显改善。

2.3 TLR4、NF-κB mRNA表达PCR检测：扩增曲线平滑、柔顺，且都在20～40个循环内，表明PCR扩增反应敏感性良好，可用于定量计算；熔解曲线分析显示，TLR4、NF-κB的Tm值分别为81℃和78℃，在荧光强度600以上，特异性扩增产物熔解温均一、峰形比较锐利，表明扩增的特异性良好。相对于空白组，内毒素性肝损伤模型组中TLR4、NF-κB mRNA表达显著下降，加入二草清肝汤后明显上升，以高剂量组最为明显，具有显著性差异，如表3、表4所示。

表3 TLR4 mRNA相对表达量多重比较分析

表4 NF-κB mRNA相对表达量多重比较分析

2.4 TLR4蛋白表达免疫组化检测：与空白组比较，内毒素性肝损伤模型组中TLR4蛋白表达明显较高，而二草清肝汤高、低剂量组的TLR4蛋白相对表达量均较模型组低，加入二草清肝汤后表达有所下降（P＜0.05），如表5所示。

表5 TLR4蛋白表达免疫组化结果多重比较分析

2.5 TLR4、NF-κB表达WB法检测：内毒素肝损伤模型组的TLR4、NF-κB的蛋白表达均较高，加入二草清肝汤后表达有所下降，结果无显著性差异（P＞0.05）。见表6。

表6 TLR4、NF-κB的表达结果多重比较分析

3 讨论

EQD是选用浙南地区特有的“鸡骨柴”和“垂盆草”为君药加用其他清热解毒利湿之药配制而成，具体方药：鸡骨草、垂盆草、苍术、茵陈、制大黄、泽泻、茯苓、陈皮、甘草。其中鸡骨草和垂盆草属于温州道地药材，其地域特色十分鲜明。温州地域多湿热天气，许多岭南中医名家应用地道草药清热利湿治疗肝病，如邱健行基于岭南湿热论辨治慢性乙型肝炎[4]。EQD中鸡骨草，性味淡微辛凉，功能清热利湿、疏肝解郁；垂盆草，性味甘淡微酸凉，功能清热解毒、利湿。二者共为君药，配加茵陈、制大黄、茯苓、泽泻、苍术、陈皮、甘草清热解毒、健脾渗湿，从而达到清热利湿、解毒退黄的治疗效果。

课题组前期研究显示，TLR4和NF-κB作为TLR4通路上起始和终极因子，其蛋白表达变化反应了TLR4通路在二草清肝汤作用下受到抑制，TLR4信号通路下游分子的产生亦减少，使炎症减轻。本次结果表明，无论是在个体水平，还是在病理水平，均显示EQD对肝损伤有抑制及促进恢复的作用。免疫组化结果显示，内毒素性肝损伤模型组中TLR4蛋白表达显著上升，加入EQD后小剂量组TLR4稍有下降，大剂量组明显下降；而虽然此次WB检测结果提示，LPS处理后的模型组中TLR4、NF-κB蛋白表达显著上升，加入二草清肝汤后TLR4、NF-κB的表达下降，但不同处理组TLR4、NF-κB蛋白表达没有显著性差异；而与上述TLR4、NF-κB蛋白表达先上升后在EQD作用下下调的趋势并不相同的是，此研究PCR结果显示，模型组中TLR4、NF-κB mRNA表达却呈下降趋势，加入二草清肝汤后其表达明显上调，提示EQD干预作用可能是在蛋白翻译层面，而非转录水平，即可能是影响了TLR4信号通路中关键分子的蛋白表达。

总之，我们的研究表明，小鼠内毒素血症时，其肝组织中TLR4、NF-κB基因在大量LPS刺激下表达程度显著上升，而EQD能抑制肝细胞内TLR4、NF-κB等信号分子活化，因此我们的结论是，EQD对LPS导致的急性肝损害具有一定的保护修复作用，其机制可能是EQD影响TLR4基因转录后蛋白的翻译过程。