补肾明目口服液治疗葡萄膜炎的网络药理学研究

刘祥 吴艳霞 蹇文渊 路雪婧

葡萄膜炎，作为临床常见的眼病，正在成为失明的主要原因之一[1]，其被广泛认为是一种自身免疫性和(或)自身炎症反应性疾病，确切发病机制仍不清楚[2]。目前西医主要使用糖皮质激素治疗，也有一些新的免疫抑制剂及生物制剂的应用[3]。葡萄膜炎属于中医学中的 “视瞻昏渺”、“瞳神紧小”、狐惑病等[4]。

已故著名中医眼科学家陈达夫先生将中医理论与当代医学知识相结合，创立了内眼结构与六经相属学说：虹膜、睫状体、视网膜都属于肝经，眼内一切色素属于肾经，故葡萄膜炎与肝肾有关[5]。陈达夫先生在临床使用的经验方补肾明目汤，后经标准化制成口服液，主要由赤芍、决明子、青葙子、三七、菟丝子、枸杞子组成，具清肝、补肾、明目之效，一直在临床应用于治疗葡萄膜炎，且有显著的效果。

网络药理学是基于系统生物学衍生出的以药物多成分、多靶点为切入点研究药物治疗疾病机制的学科[6]，切合中医整体观念，作为中药复方机制研究的新方法，有利于中医药理论的传承和发展[7]。

本研究使用网络药理学，探析补肾明目口服液治疗葡萄膜炎的有效成分及作用机制，为临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 补肾明目口服液活性成分及靶点筛选

利用TCMSP数据库[8](https://tcmspw.com/index.php)，检索赤芍、决明子、青葙子、三七、菟丝子、枸杞子6味中药的化学成分，将使用中药吸收、分布、代谢及排泄(Absorption distribution metabolism excretion,ADME)中口服利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和类药性(drug-likeness，DL)≥0.18作为筛选条件，得到活性成分及作用靶点。将获得的作用靶点信息统一在Uniprot蛋白质数据库[9](htpps://www.uniprot.org/)矫正为标准基因名称。应用Cytoscape 3.8.0软件建立中药-成分-靶点网络图。

1.2 葡萄膜炎相关靶点筛选

以“Uveitis”为关键词在DisGeNET[10](https://www.disgenet.org)、DrugBank[11]( http://www.omim.org)、GeneCards(https://www.genecards.org/)、OMIM[12](http://www.omim.org)四个数据库中检索疾病靶点，合并并去除重复得到葡萄膜炎疾病的靶点。

1.3 中药-疾病共同靶点筛选及PPI网络构建

将中药靶点与葡萄膜炎疾病靶点取交集，并利用在线绘图网站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)绘制韦恩图,得到中药-疾病共同靶点。在String数据库[13]((Version 11.0，https://string-db.org)建立共同靶点PPI网络，应用Cytoscape 3.8.0软件的插件对PPI网络进行模块化聚类分析，得出基因团簇，选取分值最高的基因团簇作为核心团簇。

1.4 中药-疾病共同靶点GO与KEGG富集分析

GO富集分析为分子功能(molecular function, MF)，生物过程(biological process, BP)和细胞组分(cellular component, CC)富集分析，KEGG富集分析为通路富集分析。Metascape平台[14](http://metascape.org/)集成了40多个知识库，支持对10多个高度研究的生物种类进行综合分析。在该平台对共同靶点进行GO富集分析，对共同靶点、核心团簇靶点进行KEGG富集分析，以P<0.1为条件进行聚类分析，并使用微生信(http://www.bioinformatics.com.cn/)对结果进行可视化。

1.5 中药活性成分-共同靶点-通路网络图构建

基于通路富集分析映射的靶点，应用Cytoscype 3.8.0软件建立中药活性成分-共同靶点-通路网络图，并进行拓扑分析，筛选得到补肾明目口服液治疗葡萄膜炎的核心活性成分和靶点。

2 结果

2.1 补肾明目口服液活性成分及靶点

通过TCMSP平台以ADME中OB≥30%和DL≥0.18为条件筛选得到补肾明目口服液中赤芍15种、枸杞子35种、决明子12种、青葙子2种、三七7种、菟丝子10种活性成分，包括β-谷甾醇、豆甾醇、山奈酚、槲皮素、人参皂苷、异鼠李素等，见表1。获得作用靶点赤芍81个、枸杞子200个、决明子64个、青葙子51个、三七183个、菟丝子208个，合并并去除重复共得到补肾明目口服液靶点246个。应用Cytoscape 3.8.0进行可视化，构建中药-成分-靶点网络图，得到一个由315个节点，1299条边构成的网络图，见图1。

表1 补肾明目口服液有效活性成分表

图1 中药-活性成分-靶点网络图

2.2 葡萄膜炎相关靶点

以“Uveitis”为关键词搜索得到疾病靶点1422个，其中DisGeNET数据库247个、DrugBank数据库96个、GeneCards数据库980个、OMIM数据库99个，合并并去除重复共得到疾病靶点1233个。

2.3 中药-疾病共同靶点及其PPI网络

取中药靶点与疾病靶点交集，用在线绘图工具绘制韦恩图，得到中药-疾病共同靶点101个，见图2。在String平台建立共同靶点PPI网络，隐藏游离节点，得到一个由99个节点，1744条边组成的网络图。故中药-疾病共同靶点最终为99个。PPI网络具模块性，对功能模块的研究可将复杂的PPI网络简化并可通过对模块功能的研究预测蛋白质的功能[15]，故为更明确的研究补肾明目口服液治疗葡萄膜炎的作用机制，在Cytoscape 3.8.0中，用MCODE插件对PPI网络进行模块化聚类分析，共得到4个基因团簇，取其中评分最高的团簇为核心团簇，有46个靶点，其由46个节点，865条边组成，见图3。

图2 中药-疾病共同靶点韦恩图

图3 中药-疾病PPI核心团簇

2.4 中药-疾病共同靶点功能与通路富集分析

在Metascape平台对共同靶点进行GO富集分析，对共同靶点和核心团簇靶点进行KEGG富集分析，并使用微生信在线平台对结果可视化，见图4、5。共同靶点的GO富集分析显示，补肾明目口服液在治疗葡萄膜炎时主要的生物学过程集中在呼吸系统发育(respiratory system development)、对革兰氏阳性细菌的防御反应(defense response to Gram-positive bacterium)、突触传递，谷氨酸能(synaptic transmission, glutamatergic)、T细胞介导的免疫(T cell mediated immunity)、负调节白细胞分化(negative regulation of leukocyte differentiation)、血浆脂蛋白颗粒水平的调节(regulation of plasma lipoprotein particle levels)等。分子功能富集在细胞因子受体结合(cytokine receptor binding)、转录因子结合(transcription factor binding)、激酶结合(kinase binding)、氧化还原酶活性(oxidoreductase activity)等。在细胞组分方面，则富集在富集在线粒体膜(mitochondrial membrane)、粘着连接(adherens junction)、PML(PML body)、细胞-底物连接(cell-substrate junction)等。KEGG富集分析显示共同靶点的通路主要富集在糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、TNF信号通路(TNF signaling pathway)、EB病毒感染(Epstein-Barr virus infection)、MAPK信号通路(MAPK signaling pathway)、疟疾(Malaria)、NF-κB信号通路(NF-kappa B signaling pathway)等。核心团簇靶点的通路主要富集在TNF信号通路(TNF signaling pathway)、癌症通路(Pathways in cancer)、流体剪应力与动脉粥样硬化(Fluid shear stress and atherosclerosis)、疟疾(Malaria)、NF-κB信号通路(NF-kappa B signaling pathway)等。其中TNF信号通路、NF-κB信号通路为共同靶点与核心团簇靶点信号通路均有的，提示补肾明目口服液可能主要通过这两个通路对葡萄膜炎起治疗作用。

图4 GO富集分析

图5 KEGG富集分析

2.5 中药活性成分-共同靶点-通路网络图

运用Cytoscape 3.8.0建立补肾明目口服液活性成分-共同靶点-通路网络图，得到一个由137个节点，787条边组成的网络图，见图6。使用软件中的NetworkAnalyzer进行拓扑分析，以度值为条件筛选得到补肾明目口服液治疗葡萄膜炎的核心活性成分及靶点，核心靶点参数见表2。结果表明，核心成分为槲皮素(Quercetin)、β-谷甾醇(Beta-sitosterol)、山奈酚(Kaempferol)、豆甾醇(Stigmasterol)等，主要靶点为PTGS2、RELA、CASP3、PIK3CG、JUN、BCL2、TNF等。

图6 中药活性成分-共同靶点-通路网络图

表2 核心靶点参数

3 讨论

补肾明目口服液为陈达夫先生立足于其所创立的内眼结构与六经相属学说而成的复方，具有补肾、清肝、明目的功效，长期应用于临床治疗葡萄膜炎。研究表明，慢性葡萄膜炎患者外周血淋巴细胞(PBL)的凋亡及凋亡相关蛋白(Fas、Fasl)表达紊乱，补肾明目口服液可纠正这种情况，增高PBL的凋亡，达到治疗葡萄膜炎的作用[16-17]，若联合常规西医治疗，可更加有效缓解眼部不适，其临床疗效显著[18]。应用网络药理学探析补肾明目口服液治疗葡萄膜炎的有效成分及作用机制对临床应用有积极意义。

在补肾明目口服液有效成分方面，综合分析得出其核心有效成分为槲皮素、β-谷甾醇、山奈酚、豆甾醇等。槲皮素具有抗氧化、抗病毒、抗菌抗炎、抗肿瘤、免疫调节等多种作用，其抗炎作用可能是通过抑制NF-κB和MAPK信号通路[19]，实验研究显示其可有效改善小鼠免疫力低下状态[20]。β-谷甾醇、山奈酚、豆甾醇具有抗氧化、抗炎、抗凋亡、免疫调节、抗肿瘤等多种作用[21-23]。故补肾明目口服液多种活性成分通过多种不同方式达到对葡萄膜炎的治疗作用。

富集分析显示，补肾明目口服液治疗葡萄膜炎的核心靶点为：PTGS2、RELA、CASP3、PIK3CG、JUN、BCL2、TNF等，主要通路为糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路、EB病毒感染、MAPK信号通路、疟疾、NF-κB信号通路等，共同靶点与核心团簇靶点通路中均有TNF和NF-κB信号通路。以上靶点和信号通路主要与炎症和免疫反应有关。研究显示，葡萄膜炎患者中具有成熟表型的血液CD1c+mDC1显著增加，且可能是由于血清中存在较高的肿瘤坏死因子(TNF-α)水平引起的，并且是p38MAPK依赖性的[24]，前期研究也表明，补肾明目口服液可以通过调节TNF家族的Fas蛋白的表达而对葡萄膜炎起治疗作用。TNF在眼部炎症中起着关键作用，TNF-α已成为非感染性葡萄膜炎生物治疗的主要目标[25]，且抗TNF-α已越来越多的应用于治疗眼部炎症[26]。核因子-κB(NF-κB)是调节细胞增殖、炎症反应和细胞黏附相关基因表达的最普遍的转录因子之一。多项研究表明，通过抑制NF-κB通路，可以有效抑制实验型葡萄膜炎的炎症反应[27-31]。氧化应激可以激活NF-κB ，从而产生眼部炎症，许多细胞因子例如TNF-α的产生是通过NF-κB依赖的转录激活介导的，因此NF-κB抑制剂及抗氧化剂阻止了NF-κB依赖的眼部炎症的激活[32]。自身免疫性葡萄膜炎中，通过活化MAPK亚族的JNK细胞通路，可调控氧化应激，从而减轻疾病症状[33]。故补肾明目口服液口服液通过抑制TNF和NF-κB信号通路、活化MAPK信号通路等可以有效的治疗葡萄膜炎。

综上，前期实验已验证补肾明目口服液可以通过TNF通路发挥治疗葡萄膜炎的作用，通过网络药理学的方法，为后期的基础实验和临床验证提供思路，为补肾明目口服液的临床应用提供更详细准确的科学依据。