柔嫩艾美耳球虫gam22基因重组质粒的免疫原性及保护效果

董 青,王京森,李 新,王晓岑,李建华

(1. 吉林大学动物医学学院,吉林 长春 130062 ； 2. 河南牧业经济学院动物医药学院,河南 郑州 450011)

鸡球虫病是由艾美耳属(Eimeria)的球虫寄生于鸡肠道引起肠道炎症、便血和产蛋率下降的寄生虫病[1]，其中柔嫩艾美耳球虫(Eimeriatenella)的致病力最强[2-3]。免疫预防是防控柔嫩艾美耳球虫病的重要手段，其中基因工程疫苗是当前研究的重要内容之一。目前已报道的柔嫩艾美耳球虫保护性抗原有虫体表面抗原(如Et3-1E和EtSAG4[4]等)、微线蛋白(如EtMIC2和EtMIC3等)、棒状体蛋白(如EtROP5和EtRON2等)以及配子体抗原(Etgam22[5]和Etgam59等)等。曹李琴[6]成功扩增出柔嫩艾美耳球虫配子体Etgam22基因，该基因的开放性阅读框大小为597 bp，编码198个氨基酸，蛋白大小约为22 kDa，通过生物信息学分析发现该基因编码区存在4个抗原决定簇，且该蛋白具有无规则卷曲、转角区域、折叠等二级结构，预示此蛋白免疫原性良好。目前使用的鸡球虫保护性抗原表达系统有原核表达、真核表达和甲病毒复制子载体等，细菌、病毒以及改造后的鸡球虫也可作为疫苗载体。甲病毒构建的重组质粒具有高效表达目的基因、引起Th1型细胞免疫反应、在胞浆中表达目的蛋白之后便引发凋亡而被机体清理、安全性好等优点，已用于弓形虫、疟原虫、柔嫩艾美耳球虫疫苗的研究。本试验选用Etgam22基因，构建pSMART2b-Etgam22重组质粒并表达该蛋白，通过动物试验检测其诱导鸡体免疫应答和抗柔嫩艾美耳球虫保护效果。

1 材料与方法

1.1 试验动物 1日龄海兰褐雏鸡，购自长春市农业科学院，饲养在无球虫环境中。

1.2 材料 柔嫩艾美耳球虫由本实验室保存，定期传代复壮；甲病毒复制子载体pSMART2b和293T细胞保存于本实验室；DH5α感受态细胞、质粒快速小提试剂盒，均购自天根生化科技(北京)有限公司；Percoll，购自GE公司；DL2 000 Marker、DL15 000 Marker、DNA胶回收试剂盒、反转录相关试剂、BamH Ⅰ和ClaⅠ限制性内切酶、PrimeSTAR GXL DNA Polymerase等，均购自TaKaRa公司；RIPA裂解液，购自碧云天生物科技有限公司；无内毒素质粒小提试剂盒，购自生工生物工程(上海)股份有限公司；ClonExpressII®One Step Cloning Kit，购自诺唯赞生物科技股份有限公司；鸡抗柔嫩艾美耳球虫阳性血清为本实验室前期制备；胎牛血清和DMEM培养基，均购自BI公司；IL-2和IFN-γ 细胞因子ELISA试剂盒，购自上海酶联生物科技有限公司。

1.3 柔嫩艾美耳球虫配子体收集

1.3.1 柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊的收集 从4 ℃冰箱中取出保存在2.5%重铬酸钾溶液中的孢子化卵囊，1 500 g离心10 min，弃掉上清，重复上述步骤3次；在沉淀中加入10% NaClO溶液，4 ℃中存放20 min杀菌，离心取沉淀加入PBS溶液，重复上述步骤3次，用一定体积PBS重悬虫体备用。

1.3.2 鸡柔嫩艾美耳球虫配子体的分离和纯化 配制SAC(1L)溶液(NaCl 9.85 g；CaCl20.55 g；葡萄糖 1.8 g；BSA 1 mg/mL；PMSF 0.17 g；Tris 1.21 g；透明质酸酶 0.5 mg/mL)备用。将1日龄雏鸡饲养在无球虫污染的环境中，于21日龄时接种1×104个孢子化卵囊，约132 h后剖杀鸡只收集盲肠，剖开盲肠后用4 ℃预冷的SAC溶液冲洗肠道，刮取肠黏膜并浸入SAC溶液中，于37 ℃恒温摇床消化1.5 h。然后分别用60目铜筛、260目网筛和17 μm孔径的滤膜过滤去除组织碎片。将收集的滤液于3 500 g离心15 min，用PBS重悬虫体，重复洗涤离心2次[7]。用PBS重悬虫体并加入红细胞裂解液，然后加入Percoll制成含有配子体的30% Percoll悬液，总体积为5 mL；取1支10 mL离心管，先向管底加入2 mL 50% Percoll分离液，再将含有配子体的30% Percoll悬液置于上层，3 500 g 水平离心10 min；将所得配子体沉淀用PBS反复洗涤5次，收集配子体沉淀保存于-20 ℃。

1.4 引物设计与合成 从NCBI数据库中获取柔嫩艾美耳球虫Etgam22基因序列(GenBank:KY887585.1)，利用Oligo 7设计扩增目的片段的引物，根据诺唯赞ClonExpressII®One Step Cloning Kit说明书，在上、下游引物的5′端加入与插入载体两端同源的序列(方框内序列)，便于用无缝克隆技术连接目的片段与载体。引物由吉林库美生物公司合成，其序列为：上游引物(Forward primer)：GCGTGGGTCTGGATCGGATCCGATGAGGACTATCCTAGCCACCC(BamH Ⅰ);下游引物(Reverse primer)：CGGGCCCTAGGATGCATCGATGTTGATGTCGGTAAGCTGCTCTT(ClaⅠ)。

1.5 Etgam22基因的PCR扩增 采用TRIzol法提取柔嫩艾美耳球虫配子体总RNA，取2 μg 总RNA用于反转录成cDNA，先加入Oligo(dT)引物1 μL，用H2O 补齐至总体积13 μL，65 ℃ 5 min，然后迅速冰浴2 min；再向上述体系中加入M-MLV 1 μL，RRI 1 μL，dNTP 1 μL，5×M-MLV Buffer 4 μL，于PCR仪中进行反转录42 ℃ 1 h，70 ℃ 15 min，4 ℃保存。以获得的cDNA为模板，按照如下反应体系(50 μL)扩增Etgam22基因：5×Buffer 10 μL，dNTP 4 μL，PrimeSTAR GXL Enzymes 1 μL，Forward primer 1 μL，Reverse primer 1 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 31 μL。将PCR扩增程序设置如下：98 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，68 ℃ 40 s，共34个循环；68 ℃再延伸5 min，4 ℃保存。将PCR产物用于凝胶电泳检测，并用胶回收试剂盒回收目的片段。

1.6 重组质粒pSMART2b-Etgam22的构建 用限制性内切酶BamHⅠ和ClaⅠ对pSMART2b载体进行双酶切，胶回收线性化pSMART2b。按照ClonExpressII®One Step Cloning Kit说明书，以无缝克隆方式将Etgam22基因与线性化pSMART2b载体进行连接。然后将重组产物转化至DH5α感受态细胞。筛选阳性单克隆菌落后，将培养获得的菌液提取质粒并进行PCR鉴定。委托吉林库美生物公司对鉴定阳性的质粒进行测序，对序列正确的菌种进行保种。

1.7 重组质粒pSMART2b-Etgam22的蛋白表达鉴定 利用无内毒素质粒提取试剂盒提取pSMART2b-Etgam22重组质粒和pSMART2b空载体，用脂质体法将两种载体分别转染至293T细胞，同时设置293T细胞空白对照。转染24 h后用RIPA裂解液提取细胞总蛋白。SDS-PAGE电泳后进行Western Blot，用鸡抗柔嫩艾美耳球虫阳性血清作为一抗，对pSMART2b-Etgam22融合蛋白进行免疫反应性分析。

1.8 雏鸡抗体水平以及IFN-γ和IL-2细胞因子的检测 选取7日龄雏鸡随机分为3组，分别为白对照组(阴性对照)、红对照组(未免疫感染组)和pSMART2b-Etgam22免疫组。将pSMART2b-Etgam22以30 μg的剂量在7、14日龄和21日龄免疫雏鸡。分别在未免疫前以及一免、二免、三免后7 d采血、收集血清，ELISA法检测Etgam22抗体水平，利用商品化ELISA试剂盒检测鸡IFN-γ和IL-2分泌水平。

1.9 抗球虫免疫保护效果评价 在28日龄时对红对照组、pSMART2b-Etgam22免疫组的每羽鸡接种1×104个柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊。观察死亡情况，攻虫1周后称重并剖杀，检测体重变化、卵囊数量、盲肠病变，计算存活率、增重率、卵囊值、盲肠病变计分，计算抗球虫指数(Anticoccidial index,ACI)=(存活率+相对增重率)-(卵囊值+病变值)，分析其保护作用。

2 结果

2.1 柔嫩艾美耳球虫gam22基因的克隆与重组质粒pSMART2b-Etgam22的构建 对PCR扩增获得的产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，得到了1条长度约597 bp的目的条带，与Etgam22基因的预期片段大小一致(图1A)。用无缝克隆技术连接的pSMART2b-Etgam22重组产物转化至DH5α感受态细胞，对筛选到的阳性菌液提取重组质粒，经琼脂糖凝胶电泳分析，得到了1条大小约13 035 bp的目的条带(图1B)。将重组质粒进行PCR鉴定，经琼脂糖凝胶电泳可观察到1条约597 bp的目的条带(图1C)。对PCR鉴定阳性的质粒进行测序，经BLAST分析发现载体上连接的目的条带与GenBank中柔嫩艾美耳球虫gam22基因序列(KY887585.1)的同源性为100%，说明重组质粒pSMART2b-Etgam22构建成功。

图1 柔嫩艾美耳球虫Etgam 22基因的克隆与重组质粒pSMART2b-Etgam22构建Fig. 1 Cloning of E.tenella gam 22 gene and construction of recombinant plasmid pSMART2b-Etgam22A：Etgam22的PCR扩增(M： DL-2 000 DNA相对分子质量标准； 1：Etgam22基因PCR产物)； B：pSMART2b-Etgam22的构建(M： DL-15 000 DNA相对分子质量标准； 1：重组质粒pSMART2b-Etgam22)； C：Etgam22的PCR鉴定(M： DL-2 000 DNA相对分子质量标准； 1：重组质粒pSMART2b-Etgam22的PCR鉴定)A：PCR amplification of Etgam22； B：Construction of pSMART2b-Etgam22； C：PCR identification of Etgam22

2.2 pSMART2b-Etgam22蛋白表达分析 收取细胞蛋白进行SDS-PAGE电泳,发现重组质粒pSMART2b-Etgam22转染细胞样品约在57kDa位置处有特异条带，空载pSMART2b本身表达的蛋白约35kDa，而在57kDa处无条带，说明目的基因在293T细胞中得到了表达(图2A)。进行Western Blot分析，与293T细胞蛋白(Negative control)和转染pSMART2b的293T细胞蛋白(pSMART2b)相比，pSMART2b-Etgam22转染组细胞蛋白可在约57 kDa处观察到1条被抗柔嫩艾美耳球虫阳性血清识别的单一条带(图2B)，与该融合蛋白的理论大小一致，说明pSMART2b-Etgam22融合蛋白成功表达，且具有良好的免疫反应性。

图2 pSMART2b-Etgam22转染293T细胞后表达蛋白的分析Fig. 2 Analysis of the protein expression by pSMART2b-Etgam22 after transfection into 293T cellsA：考马斯亮蓝染色； B：Western BlotA：Coomassie brilliant blue staining； B：Western Blot (M：蛋白Marker； 1：pSMART2b-Etgam22； 2：pSMART2b； 3：293T细胞)

2.3 雏鸡抗体水平和细胞因子水平检测 每次免疫和攻虫前心脏采血收集血清，用ELISA法检测鸡体的抗体水平。结果显示免疫前与一免后pSMART2b-Etgam22组与白对照组相比抗体水平差异不显著(P>0.05)，在二免和三免后随着免疫次数的增加，pSMART2b-Etgam22组的抗体水平与白对照组相比显著升高(P<0.01)(图3)。

图3 鸡血清中抗体水平变化Fig.3 The changing antibody levels in chicken serum**：差异完全显著，P<0.01；ns：差异不显著，P>0.05；下图同 **：Difference was completely significant，P<0.01； ns：No significant difference，P>0.05. The same as below

ELISA试剂盒检测鸡只IFN-γ和IL-2水平变化，结果显示，在免疫前与一免后pSMART2b-Etgam22组与白对照组相比IFN-γ和IL-2水平差异不显著(P>0.05)，随着免疫次数的增加，pSMART2b-Etgam22组免疫鸡只的IFN-γ和IL-2水平与白对照组相比升高显著(P<0.01)(图4、图5)。

图4 鸡血清中IFN-γ含量Fig. 4 The quantity of IFN-γ in chicken serum

图5 鸡血清中IL-2含量Fig. 5 The quantity of IL-2 in chicken serum

2.4 抗柔嫩艾美耳球虫的保护效果评价 与红对照组相比，pSMART2b-Etgam22免疫组增重明显(P<0.01)，卵囊排出量显著降低，卵囊数量减少率为68.05%，盲肠病变计分降低(表1)，死亡率降低，相对增重率增高，病变值和卵囊值变低(表2)。综合评价pSMART2b-Etgam22免疫组的抗球虫指数为165(表2)，显示良好的抗柔嫩艾美耳球虫免疫保护效果。

表1 重组质粒pSMART2b-Etgam22抗柔嫩艾美耳球虫保护效果Table 1 The protective efficacy of recombinant plasmid pSMART2b-Etgam22 against E. tenella challenge infection

表2 重组质粒pSMART2b-Etgam22抗柔嫩艾美耳球虫指数(ACI)Table 2 Anticoccidial index of recombinant plasmid pSMART2b-Etgam22 after E. tenella challenge infection

3 讨论

巨型艾美耳球虫(Eimeriamaixma)的配子体灭活抗原(主要为Emgam56、Emgam230和Emgam82)是商品化亚单位疫苗CoxAbic的主要抗原成分，该疫苗能显著降低毒害艾美耳球虫、柔嫩艾美耳球虫和堆型艾美耳球虫的卵囊排出量[9]。目前鸡球虫配子体抗原研究较少，只有少数几种被发现并用于疫苗研究，如柔嫩艾美耳球虫Etgam56、Etgam59和Etgam22，毒害艾美耳球虫Engam22，堆型艾美尔球虫Eagam56，巨型艾美耳球虫Emgam56、Emgam82和Emgam230。这些抗原在这3种艾美耳球虫中同源且有许多共同点，都具有较好的免疫保护原性[10]。张艳[11]选用巨型艾美耳球虫Emgam56基因制备DNA疫苗pcDNA-Emgam56，该疫苗能使感染鸡只体重相对增重89.7%，卵囊排出量减少53.7%，说明Emgam56具有较好的免疫原性，可对免疫鸡只提供较好的免疫保护效果。刘悦等[12]发现柔嫩艾美耳球虫配子体Etgam56具有较好的抗原性和交叉性，可分别被柔嫩艾美耳球虫鸡康复血清和毒害艾美耳球虫鸡康复血清识别。Stefanie等[13]发现鼠源Etgam56单克隆抗体腹腔接种感染柔嫩艾美耳球虫的鸡只后，可使卵囊减少率为78%，对该抗体识别的抗原决定部位(Etgam56的N端部分)进行原核表达，制备的重组蛋白疫苗不能为鸡只提供有效的免疫保护，这可能与抗原的构象有关。朱玉兰[14]对柔嫩艾美耳球虫Etgam59进行原核表达，制备重组蛋白疫苗进行保护性研究，结果发现免疫组卵囊减少率为58.9%，该疫苗具有一定保护效果。堆型艾美耳球虫重组蛋白rEagam56和rEagam82及两者的联合免疫均能给鸡只提供一定免疫保护，疫苗组的ACI分别为148.24、143.92和148.74。

与gam56和gam82相似，gam22参与形成毒害艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫等球虫的卵囊壁，具有成为免疫保护性抗原的潜力[15-16]。曹李琴[6]用原核表达系统表达柔嫩艾美耳球虫配子体Etgam22蛋白，制备疫苗后进行动物试验，柔嫩艾美耳球虫的卵囊减少率为23.83%。Rafiqi等[5]同样利用原核表达系统表达柔嫩艾美耳球虫Etgam22蛋白，以Montanide ISA 71 VG为佐剂制备重组蛋白疫苗，动物试验表明该疫苗可使每克粪便卵囊数减少68.5%，总卵囊减少率为45.23%。用毒害艾美耳球虫重组配子体蛋白rEngam22与rEngam59联合免疫鸡只，发现免疫后的感染鸡只相对增重率为97.02%，卵囊减少率为41.93%[17]。本试验采用的pSMART2b是基于塞姆利基森林病毒(Semliki forest virus,SFV)改造的DNA载体，具有高效率的真核表达调控元件等，如启动子人巨噬细胞病毒(Cytomegalovirus，CMV)[18]。邓瑶等[19]比较了与传统 DNA 疫苗载体pcDNA3.1在转染和蛋白表达效率方面的不同，结果发现在同等剂量以及同等情况下转染细胞后，基于甲病毒衍生的载体表达量是 pcDNA3.1 载体的3倍左右，这表明了基于甲病毒衍生的复制型载体在基因工程苗应用方面的优势。目前甲病毒复制子载体在寄生虫 DNA疫苗方面的应用还较少。朱刚[20]选择甲病毒复制子载体和弓形虫表面膜蛋白 SAG3构建重组质粒pSMART2b-SAG3，分3次免疫小鼠并做攻虫试验。结果证明pSMART2b-SAG3可使免疫组小鼠存活率升高，对照组小鼠全部死亡，说明重组质粒对小鼠抗弓形虫感染可以产生一定的保护力。在鸡球虫疫苗方面，祝涛[21]构建了重组质粒 pSMART2b-Rhomboid3并制备疫苗免疫雏鸡，该疫苗的ACI 达到 184.22。本试验利用甲病毒表达系统来表达抗原基因Etgam22，结果显示将pSMART2b-Etgam22免疫雏鸡后可成功诱导鸡体产生免疫应答，动物试验表明柔嫩艾美耳球虫卵囊排出量减少，减少率为68.05%，其抗球虫指数为165，具有一定抗球虫保护效果。提示该表达系统在鸡球虫疫苗研制中具有较好的应用潜力,在后续的工作中需要对免疫剂量、使用佐剂和免疫程序等方面进行优化，为进一步制备鸡球虫疫苗提供了科学依据。