鸡和缓艾美耳球虫早熟虫株选育及其生物学特性研究

王 娟，刘永清，高永刚，梁 伟，闵长安，付改玲，张文叶，郑润宽

（1.内蒙古神元生物工程股份有限公司，内蒙古 呼和浩特 010010；2.内蒙古农牧业科学院，内蒙古 呼和浩特 010031）

鸡和缓艾美耳球虫早熟虫株选育及其生物学特性研究

王 娟1*，刘永清1*，高永刚1，梁 伟1，闵长安1，付改玲1，张文叶1，郑润宽2

（1.内蒙古神元生物工程股份有限公司，内蒙古 呼和浩特 010010；2.内蒙古农牧业科学院，内蒙古 呼和浩特 010031）

按照Jeffers1975年建立的艾美耳属球虫早熟虫株选育方法，对鸡和缓艾美耳球虫巴彦淖尔株（SY-MB株）进行了单卵囊分离、扩增和早熟虫株的选育。经SPF鸡15代传代之后，分离株的潜隐期由96 h缩短至77 h，缩短了19 h。按索勋等1998年建立的方法对选育出的和缓艾美耳球虫巴彦淖尔早熟株（SY-mb77株）进行10代非选择性传代，证明该早熟虫株的潜隐期、卵囊产量、免疫原性和致病性均具备早熟虫株特性，并能有效抵抗强毒虫株的攻击。

鸡和缓艾美耳球虫；早熟虫株；选育；生物学特性

我国的鸡艾美耳球虫病十分普遍，其发病率50%～70%；死亡率20%～30%，严重时达80%［1］。在鸡病中，鸡球虫病占16%～20%［2］。每年我国养鸡量达30亿～60亿羽，按0.2～0.3元/只计算［3］，我国每年抗球虫药支出6亿～18亿元。时至今日该病的防治仍然严重依赖各种化学抗球虫药物。为了有效控制鸡球虫病发生、减少化学药物的使用，应大力提倡绿色无公害防治技术，积极开发、应用鸡球虫疫苗。该研究目的在于选育鸡球虫早熟弱毒疫苗的抗原虫株。

2003年笔者在内蒙古巴彦淖尔市某鸡场分离到1株和缓艾美耳球虫，经单卵囊分离扩增和毒力测定后，确定为潜隐期96 h的强毒虫株，排卵囊高峰在感染后第6天，该虫株记为和缓艾美耳球虫巴彦淖尔株（SY-MB株）。以下将对和缓艾美耳球虫巴彦淖尔株（SY-MB株）进行早熟选育，并对选育出的和缓艾美耳球虫巴彦淖尔早熟株 （SY-mb77株）的生物学特性进行研究。

1 材料与方法

1.1 实验动物及饲料 1～2周龄SPF鸡饲养于专用隔离器内。饲料无球虫污染，无抗球虫药物添加。

1.2 试验虫株 和缓艾美耳球虫巴彦淖尔株（SYMB株）由内蒙古神元生物工程股份有限公司分离、鉴定、保存。

1.3 早熟选育

1.3.1 虫株复壮：取和缓艾美耳球虫巴彦淖尔株（SY-MB株）孢子化卵囊保存液，在2 500 r/min下离心10 min，弃去保存液，加等量蒸馏水重悬。取10 μL重悬的卵囊液加蒸馏水稀释成1 mL，再取10 μL滴在载玻片上进行卵囊计数，重复2次，按平均数配制成每毫升含卵囊为2×103个的卵囊液。选7日龄SPF鸡5只，每只经口接种卵囊液1 mL，收集接种后4～7 d的粪便，分离卵囊并进行孢子化后，加蒸馏水配成2×103个/mL的卵囊液，用于早熟虫株的选育。

表1 和缓艾美耳球虫巴彦淖尔早熟株的选育

1.3.2 早熟虫株的选育：按Jeffers创立的艾美耳球虫早熟虫株选育方法进行［4］，7日龄SPF鸡经口接种上述孢子化卵囊1 mL。之后每日检查粪便，在卵囊排出前每2 h检查粪便，用饱和盐水漂浮法检查其中有无球虫卵囊出现，将最早检出卵囊的时间记为该次传代的潜隐期，收集最初数小时排出的卵囊，重复以上传代过程，直至潜隐期缩短到一定程度为止。该试验对和缓艾美耳球虫巴彦淖尔株（SYMB株）进行了15次传代，标记为P0、P1、P2、……P15（F0代），进行15次传代后所得到的和缓艾美耳球虫记为和缓艾美耳球虫巴彦淖尔早熟株（SY-mb77株）。

1.4 早熟虫株的生物学特性研究

1.4.1 早熟虫株潜隐期测定：14日龄 SPF鸡 10只，每只经口接种和缓艾美耳球虫巴彦淖尔早熟株（SY-mb77株）孢子化卵囊2×103个，感染后每日收粪检卵，按最早检出卵囊时间确定潜隐期。连续感染10代次，检测每次感染的潜隐期。

1.4.2 早熟虫株的繁殖力测定：将80只14日龄SPF鸡分成A、B、C、D、E、F、G、H共8组，每组10只。A、B组每只鸡接种2×103个和缓艾美耳球虫巴彦淖尔早熟株（SY-mb77株）孢子化卵囊；C、D组每只鸡接种 2×103个和缓艾美耳球虫巴彦淖尔株（SY-MB株）孢子化卵囊；E、F组每只鸡接种1×104个和缓艾美耳球虫巴彦淖尔早熟株 （SY-mb77株）孢子化卵囊；G、H组每只鸡接种1×104个和缓艾美耳球虫巴彦淖尔株（SY-MB株）孢子化卵囊。比较亲本株与早熟株的产卵囊量，进行繁殖力评估。

1.4.3 早熟虫株的致病力测定：选取90只7日龄SPF鸡分成3个组，每组30只鸡，10只鸡为一个试验小组，共设3个重复。第1组每只接种1×105个和缓艾美耳球虫巴彦淖尔早熟株 （SY-mb77株）孢子化卵囊，第2组每只鸡接种1×105个和缓艾美耳球虫巴彦淖尔株（SY-MB株）孢子化卵囊，第3组不感染为对照组。接种后计算1～10 d内的平均增重量，以评价和缓艾美耳球虫巴彦淖尔早熟株（SY-mb77株）的致病性。

1.4.4 早熟虫株的免疫原性测定：选取90只14日龄SPF鸡分成3个组，每组30只鸡，10只鸡为一个试验小组，共设3个重复。第1组和第2组在10日龄分别用4.0×102个和缓艾美耳球虫巴彦淖尔早熟株（SY-mb77株）及和缓艾美耳球虫巴彦淖尔株（SY-MB株）孢子化卵囊免疫，第3组不免疫为对照组；免疫后第14天时3个组均用5×104个和缓艾美耳球虫巴彦淖尔株（SY-MB株）孢子化卵囊攻虫，用各免疫组与对照组卵囊产量作为判断免疫原性的指标。

2 试验结果

2.1 早熟虫株选育结果 和缓艾美耳球虫巴彦淖尔株（SY-MB株）在传到13代时其潜隐期由96 h缩短为77 h，缩短了19 h，且后续传代显示稳定（结果见表1）。

2.2 早熟虫株的生物学特性研究结果

2.2.1 早熟虫株潜隐期测定结果：通过10代非选择性传代，已选育的和缓艾美耳球虫早熟株的潜隐期均为77 h，保持了良好的遗传稳定性（结果见表2）。

2.2.2 早熟虫株繁殖力测定结果：表3为和缓艾美耳球虫巴彦淖尔早熟株（SY-mb77株）与和缓艾美耳球虫巴彦淖尔株（SY-MB株）的卵囊产量，数据表明，与相同剂量的亲本株相比，早熟株的卵囊产量显著降低。

表2 和缓艾美耳球虫早熟株潜隐期测定

表3 早熟虫株与亲本虫株的繁殖力比较

2.2.3 早熟虫株的致病力测定结果：和缓艾美耳球虫早熟株致病力试验的结果见表4。与亲本虫株组相比，在相同的接种剂量下，早熟虫株组的试验鸡的体重增长明显高于亲本虫株组（P<0.05），说明和缓艾美耳球虫巴彦淖尔早熟株（SY-mb77株）的致病性明显降低。

表4 和缓艾美耳球虫早熟株致病力试验结果

统计学分析表明，第1组与第3组无统计学差异；而接种亲本株的第2组和接种早熟株的第1组、对照组相比较，均有显著性差异（P＜0.05）。

2.2.4 早熟虫株的免疫原性测定结果：和缓艾美耳球虫早熟株与亲本株卵囊的免疫原性测定结果见表5。以4×102个孢子化卵囊为1个免疫剂量，分别接种试验鸡后，第14天用5×104个亲本株卵囊攻虫，以第4天至第8天每鸡的产卵囊量评价早熟虫株、亲本虫株的免疫原性。结果表明：接种早熟株、亲本株卵囊的试验鸡的产卵量比对照组鸡极显著降低（P<0.01），分别降低20倍和300倍以上，有效地抵抗了强毒虫株的攻击，表明该2个虫株均有良好的免疫原性。

表5 和缓艾美耳球虫早熟株与亲本株免疫原性测定

由于和缓艾美耳球虫的致病力弱，攻虫不出现试验鸡死亡，故以卵囊产量评估其免疫原性为行业公知。

3 结论

该研究取得以下结论：以和缓艾美耳球虫巴彦淖尔株（SY-MB株）为亲本虫株，经15代早熟选育，获得了潜隐期为77 h的早熟虫株——和缓艾美耳球虫巴彦淖尔早熟株（SY-mb77株）。对该早熟虫株的进一步研究证明，早熟虫株具有良好的遗传稳定性和免疫原性，并且致病性和产卵量降低，可作为鸡球虫病活疫苗的抗原虫株。

4 讨论

公认的7种有致病力的鸡艾美耳球虫中［5-6］，和缓艾美耳球虫是致病性较低的一种。笔者在巴彦淖尔市某鸡场分离到1株和缓艾美耳球虫，经单卵囊分离扩增后，测得其潜隐期为96 h，排卵囊高峰在感染后第6天；用1×105个孢子化卵囊经口接种试验鸡发现，试验鸡接种后2周内的增重较对照组低10%以上，说明该株和缓艾美耳球虫有一定的致病性。

自Jeffers1975年首次报道鸡柔嫩艾美耳球虫早熟株选育以来［7］，世界各国相继报道了毒害艾美耳球虫［7］、巨型艾美耳球虫［8］和堆型艾美耳球虫［9］的早熟选育。该试验针对和缓艾美耳球虫的早熟选育同样采用了Jeffers的方法，选育后的早熟虫株的潜隐期缩短、排卵囊高峰提前、卵囊产量（繁殖力）下降、致病性降低，但保持了免疫原性，符合早熟虫株的标准。

［1］孔繁瑶.家畜寄生虫学［M］.北京：农业出版社，1981.

［2］左仰贤.球虫学——畜禽和人体的球虫与球虫病［M］.天津：天津科学技术出版社，1991.

［3］郁明发.鸡球虫病［J］.上海畜牧兽医通讯，1989（1）：36-37.

［4］JEFFERS T K.Attenuation of Eimeria tenella through selection for precociousness［J］.J Parasitol，1975，61（6）：1083-1090.

［5］索勋，李国清.鸡球虫病学［M］.北京：中国农业大学出版社，1998.

［6］WILLIAMS R B，BUSHELL A C，REPERANT J M，et al.A survey ofEimeria speciesin commercially-reared chickens in France during 1994 ［J］.Avian Pathol，1996，25（1）：113-130.

［7］SHIRLEY M W，BELLATTIM A.Eimerianecatrix：selection and characteristicsofa precocious （and attenuated）line［J］.Avian Pathol，1984，13（4）：657-668.

［8］SHIRLEY M W，BELLATTIM A.Live attenuated coccidiosis vaccine：selection of a second precocious line of Eimeria maxima［J］.Res Vet Sci，1988，44（1）：25-28.

［9］McDONALDV，BALLINGALLS，SHIRLEYM W.A preliminary study of the nature of infection and immunity in chickens given an attenuated line of Eimeria acervulina［J］.Parasitology，1982，84（1）：21-30.

Selection and Biological Characteristic of Precocious Strain of Chicken Eimeria mitis

WANG Juan1*，LIU Yong-qing1*，GAO Yong-gang1，LIANG Wei1，MIN Chang-an1，FU Gai-ling1，ZHANG Wen-ye1，ZHENG Run-kuan2
（1.Inner Mongolia Shenyuan Bioengineering Co.，Ltd.，Hohhot 010010，China；2.Inner Mongolia Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences，Hohhot010031，China）

The single oocyst separation,propagation and precocious strain selection were conducted in a strain of chicken Eimeria mitis designated as SY-MB which was isolated from Bayannur region of Inner Monlolia according to the methods established by Jeffers in 1975.After 15 successive generations inoculation,the latent period of the isolated strain was 19 hours shorted （from 96 hours to 77 hours）.The selected precocious strain designated as SY-mb77 was unselectively sub-cultured for 10 generations by the methods reported by Sunxun and others in 1998.The latent period,oocyst production,immunogenicity and pathogenicity of the selected strain possessed the characteristic of a typical precocious strain.The precocious strain can effectively protect the inoculated chickens from invasion of high virulent strain.

chicken Eimeria mitis；precocious strain；selection；biological characteristic

S852.72；S852.43

A文章顺序编号：1672-5190（2016）09-0015-04

2016-08-24

项目来源：呼和浩特市重大科技专项项目（2011-合-4）。

王娟（1986—），女，主要从事鸡球虫早熟弱毒疫苗的研究工作。刘永清（1983—），男，主要从事鸡球虫早熟弱毒疫苗的研究工作。

*王娟、刘永清为并列第一作者。

郑润宽（1957—），男，研究员，硕士，主要研究方向为预防兽医学。

（责任编辑：钱英红）