猪圆环病毒2型合成肽间接ELISA抗体检测方法的建立和评估

栗利芳,刘新月,张 蕾,董春娜,肖 进,汪 明,郭 鑫

(1. 中国农业大学动物医学院,北京 海淀 100193 ； 2. 中牧实业股份有限公司 农业农村部兽用生物制品 与化药重点实验室 北京市兽用多肽疫苗设计与制备工程技术中心,北京 海淀 100095)

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)是一种严重危害养猪生产的重要病原，与猪圆环病毒相关疾病(Porcine circovirus associated diseases，PCVAD)的发生密切相关，给养猪业造成巨大的经济损失[1]。伴随着我国养猪业受到PCV2的危害日益严重，研制更好的PCV2血清抗体检测方法的需求也变得越来越迫切。目前，PCV2抗体的血清学检测方法较多，其中ELISA方法因其方便快捷和能大规模检测，较为常用[2]。近年来，随着表位研究的不断深入，合成肽除了用作圆环病毒表位疫苗的研究，还应用于ELISA反应中包被抗原的筛选。研究表明在PCV2 Cap蛋白上含有多个主要抗原表位，具有良好的免疫原性和反应原性，是检测该种病毒抗体的理想靶位[3]。本试验在表位研究的基础上，建立了基于合成肽包被抗原的用于检测猪圆环病毒2型抗体的间接ELISA检测方法，该方法可以作为临床PCV2血清抗体检测及作为疫苗免疫效果评价的技术手段。

1 材料与方法

1.1 合成肽抗原 0701、0702、0703、0704、0705、0706、0707、0708，从PCV2 Cap蛋白表位筛选，由中牧实业股份有限公司研究院制备。

1.2 主要试剂及设备 兔抗猪IgG酶标二抗，购自Sigma公司；其他ELISA相关试剂，均购自Amresco公司； PCV2 Cap蛋白包被试剂盒，由南京农业大学友情馈赠；猪圆环病毒2-dCap-ELISA抗体检测试剂盒(锐捷)，购自保定瑞普生物药业有限公司。酶标仪，美国 Bio-Rad公司；全自动多肽合成仪PSI300，购自美国多肽科技有限公司。

1.3 试验用血清 用于包被抗原筛选的120份PCV2阳性血清，由中牧实业股份有限公司兰州生物药厂提供；猪圆环阴、阳性对照血清，50份猪圆环病毒感染猪血清，50份猪圆环疫苗免疫血清，30份猪圆环抗体阴性血清，由中牧实业股份有限公司兰州生物药厂提供；猪瘟病毒(CSFV)阳性血清、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)阳性血清和猪伪狂犬病毒(PRV)阳性血清，均购自中国兽医药品监察所；猪口蹄疫O型病毒(FMDV)阳性血清、猪口蹄疫A型病毒阳性血清和130份临床猪血清，由中牧实业股份有限公司兰州生物药厂提供。

1.4 试验方法

1.4.1 合成肽包被抗原的设计、合成与筛选 通过分析PCV2 Cap蛋白表位，结合文献报道及软件预测，对PCV2 Cap蛋白上的抗原表位进行筛选，用化学合成方法分段合成，获得8条合成肽抗原0701、0702、0703、0704、0705、0706、0707、0708。用化学方法对这些抗原表位肽段合成，作为包被抗原，相应PCV2阳性血清为一抗，HRP标记的兔抗猪IgG作为二抗，参照常规间接 ELISA 方法对潜在表位进行筛选鉴定，筛选出反应最强的候选肽段，并通过对120份临床血清进行检测进一步确定包被抗原。

1.4.2 最佳抗原包被浓度和血清稀释倍数的测定 采用棋盘法来筛选。将合成肽抗原用包被液(0.05 mol/L碳酸盐缓冲液，pH=9.6)分别稀释至每条肽浓度为8、4、2、1、0.5 μg/mL和0.25 μg/mL；分别加入1∶50、1∶100、1∶200、1∶400和1∶800稀释的阳性血清，比较P/N值。以阳性血清OD450值达到并接近1.0，且P/N值最大的孔所在的抗原浓度和稀释倍数为最佳抗原包被浓度和血清稀释倍数。

1.4.3 最佳封闭液的筛选 酶标板按选择的条件包被后，分别用0.5%、1%和1.5%BSA的 PBST(0.01 mol/L，pH=7.2)进行2 h封闭试验，选择P/N值最大孔为最适封闭条件。

1.4.4 待检血清作用时间的筛选 酶标板按选择的条件包被、封闭后，加入阴阳性血清，37 ℃分别作用0.5、1、1.5 h和2 h，进行ELISA测定，选择合适的血清作用时间。

1.4.5 酶标抗体工作浓度的筛选 阴阳性血清按1.4.4确定的时间作用后，将酶标抗体进行1∶3 000、1∶5 000、 1∶10 000 和1∶20 000稀释，100 μL/孔进行ELISA测定，选择合适的酶标抗体工作浓度。

1.4.6 酶标抗体作用时间的筛选 将酶标抗体按确定好的稀释倍数加入酶标板后，37 ℃分别作用0.5、1 h和1.5 h，进行ELISA测定，选择合适的酶标抗体作用时间。

1.4.7 底物反应时间的确定 加入底物后在37 ℃分别反应10、15 min和20 min，选择最佳底物反应时间。

1.4.9 敏感性试验 采用已建立的ELISA方法对50份猪圆环感染猪血清和50份猪圆环疫苗免疫血清进行检测，确定该方法的敏感性。

1.4.10 特异性试验 采用已建立的ELISA方法，分别检测CSFV、FMDV、PRV、PRRSV及30份PCV2抗体阴性血清，确定该方法的特异性。

1.4.11 重复性试验 选取PCV2阴性血清、阳性血清各5份，用3个批次的合成肽抗原包被板按照上述筛选方法进行ELISA检测，另外采用同一批次不同包被板，进行ELISA检测，分别计算批间变异系数和批内变异系数，分析该方法的重复性。

1.4.12 符合率试验 分别用PCV2 Cap蛋白包被试剂盒、猪圆环病毒2-dCap-ELISA抗体检测试剂盒(锐捷)和本试验建立的方法，检测130份临床血清，计算本方法与这2种检测方法的符合率。

2 结果

2.1 合成肽包被抗原的设计、合成与筛选 通过分析PCV2 Cap蛋白表位，结合文献报道及软件预测，对PCV2 Cap蛋白上的抗原表位进行筛选，用化学合成方法分段合成，获得合成肽抗原，见表1。

表1 猪圆环病毒2型候选合成肽包被抗原Table 1 Candidate synthetic peptide coat antigens of PCV2

2.1.1 合成肽包被抗原的筛选 分别以合成肽抗原(0701、0702、0703、0704、0705、0706、0707、0708)作为包被抗原，PCV2阳性血清和阴性血清作为一抗，对潜在表位进行筛选鉴定。结果显示，0701、0703、0706、0708作为包被抗原P/N值较高。因而确定0701、0703、0706、0708合成肽抗原为猪圆环病毒2型ELISA抗体检测包被抗原。结果见图1。

2.1.2 合成肽包被抗原的评价 将0701、0703、0706、0708以单条肽和4条肽混合肽(每条肽浓度均为1 μg/mL)，作为包被抗原，分别对120份临床血清进行检测。0701、0703、0706、0708单条肽和4条肽混合肽作为包被抗原对120份临床血清的阳性检出率分别为39.2%、37.5%、40.0%、38.3%和46.7%，表明以混合肽作为包被抗原对临床血清的阳性检出率高于单条肽作为包被抗原的阳性检出率，因此选择4条肽的混合肽作为包被抗原。结果见表2。

图1 候选合成肽包被抗原的筛选Fig.1 Screening results of candidate synthetic peptide coating antigens标记不同的字母表示差异显著(P<0.05); 下同Marking different letters indicated significant differences (P<0.05). The same as below

表2 单条肽和混合肽作为包被抗原对120份临床血清的检测结果Table 2 Test results of 120 clinical sera with single peptide and mixed peptide as coating antigens

2.2 最佳抗原包被浓度和血清稀释倍数的测定 试验结果显示，当抗原包被浓度为每条肽2 μg/mL，血清稀释度为1∶200时，阳性血清OD值大于并接近1.0，P/N值最大。从而确定抗原最佳包被浓度为每条肽2 μg/mL，血清最佳稀释度为1∶200。结果见表3。

2.3 最佳封闭液的筛选 分别用含0.5%、1%和1.5%BSA的 PBST(0.01 mol/L，pH=7.2)封闭2 h， 显示用1.5%BSA封闭的P/N值最高，效果最好。结果见图2。

2.4 待检血清作用时间的筛选 阴阳性血清分别反应0.5、1、1.5 h和2 h，显示当阳性血清作用1 h时，P/N值最高，因此优选1 h作为待检血清作用时间。结果见图3。

表3 最佳抗原包被浓度和血清稀释度的确定(P/N比值)Table 3 Determination of optimal concentration of coating antigen and serum dilution(P/N value)

图2 最佳封闭条件的筛选Fig.2 Screening of optimal sealing conditions

图3 待检血清反应时间的筛选Fig.3 Screening of optimal reaction time for test serum

2.5 酶标抗体工作浓度的筛选 酶标抗体按1∶3 000、 1∶5 000、1∶10 000 和1∶20 000倍稀释，进行ELISA反应，结果显示当酶标抗体1∶10 000稀释时，P/N值最高。结果见图4。

2.6 酶标抗体作用时间的筛选 酶标抗体按1∶10 000 稀释加入酶标板，37 ℃分别作用0.5、1 h和1.5 h，显示当酶标抗体作用1 h时，P/N值最高。结果见图5。

2.7 底物反应时间的确定 加入底物后在37 ℃分别显色10、15 min和20 min，进行ELISA测定，显示当底物显色15 min时，P/N值最高。结果见图6。

图4 酶标抗体工作浓度的筛选Fig.4 Screening of optimal working concentration of enzyme labeled antibody

图5 酶标抗体作用时间的筛选Fig.5 Screening of optimal action time of enzyme labeled antibody

图6 底物作用时间的筛选Fig.6 Screening of optimal substrate reaction time

2.9 敏感性试验 用50份猪圆环感染猪血清和50份猪圆环疫苗免疫血清，采用本试验建立的方法进行检测，结果95份检测为阳性，5份检测为阴性，计算敏感性为95.0%(95/100)。结果见表4。

表4 敏感性试验结果Table 4 Results of sensitivity test

2.10 特异性试验 用该方法分别检测30份猪圆环抗体阴性血清，仅有1份显示阳性；而对CSFV、FMDV、PRV、PRRSV阳性血清检测均显示阴性，计算特异性为97.5%(39/40)。结果见表5。

表5 特异性试验结果Table 5 Results of specificity test

2.11 重复性试验 将选取的10份猪血清分别进行批内和批间重复性检测，结果显示批内变异系数为3.4%～7.2%，批间变异系数为4.8%～8.6%，表明该方法重复性和稳定性较好。结果见表6。

表6 重复性试验结果Table 6 Results of repeatability test

2.12 符合率试验 分别用PCV2 Cap蛋白包被试剂盒(PCV2-Cap-ELISA)、猪圆环病毒2-dCap-ELISA抗体检测试剂盒(锐捷)和本试验建立的方法，检测130份临床血清，计算本方法与这2种试剂盒的符合率。本方法检测130份临床血清，结果可见112份为阳性，18份为阴性；PCV2-Cap-ELISA方法检出阳性108份，阴性21份；PCV2-dCap-ELISA抗体检测试剂盒(锐捷)检出阳性为115份，阴性为15份。本方法和PCV2-Cap-ELISA方法符合率为91.5%，和PCV2-dCap-ELISA抗体检测试剂盒(锐捷)符合率为94.6%。结果见表7。

表7 间接ELISA与其他试剂盒比对试验结果Table 7 Comparsion between indirect ELISA and other kits

3 讨论

PCV2的抗体检测在PCV2流行病学调查、阴性仔猪筛选、疫苗免疫效果评价等多方面均有较为重要的作用。目前针对PCV2的抗体检测方法主要有病毒中和试验(SN)、间接免疫荧光试验(IFA)、免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)和酶联免疫吸附试验，前三者均需要感染性病毒，在制备过程中存在散毒危险，同时难以满足自动化、高通量检测需求，且在结果判定方面还存在一定的主观因素，因此推广和使用均受到限制[4]。而ELISA方法操作简单，特异性好，敏感性高，能快速检测大量的样品，因此仍是现阶段临床最主要的检测方法。

Cap蛋白是PCV2的主要结构蛋白，由PCV2ORF2编码，表达的PCV2 Cap蛋白常用于基因工程疫苗的研究和诊断抗原的使用[5]。国内目前批准的商品化猪圆环病毒2-dCap-ELISA抗体检测试剂盒(锐捷)也是采用Cap蛋白包被抗原，市场使用效果较好。最近的对于PCV3间接ELISA抗体检测方法的研究也采用了Cap蛋白作为包被抗原[6]，可见现有圆环病毒ELISA抗体检测基本还局限于包被Cap蛋白的方法。但也有研究者认为，基因工程表达的Cap蛋白受纯化技术等限制原因，无法去除杂蛋白干扰，容易造成假阳性。曹晶晶等以5H7酶标鼠单抗为基础，建立了PCV2 Cap蛋白的阻断ELISA抗体检测方法,特异性更好，能更准确的反应血清抗体水平[7]。本试验中所采用的合成肽是针对特定抗原位点设计合成，与相应抗体的结合力强，以此为包被抗原建立的ELISA抗体检测方法敏感性、特异性更高，能更好避免传统试剂盒的缺陷。近年合成肽作为包被抗原也成功应用在口蹄疫ELISA抗体检测上，所建立的猪、牛口蹄疫O型VP1合成肽ELISA抗体检测方法已进入市场并广泛应用[8-9]。

研究表明，在PCV2 Cap蛋白上含有多个抗原表位，如92～103 aa、156～162 aa、175～192 aa、195～201 aa和231～233 aa等都是高免疫原性的表位[10]。刘博奇等选取PCV2 Cap蛋白的65～87 aa、113～146 aa、158～183 aa、194～207 aa等表位，化学合成制备疫苗取得显著的免疫效果[11]。本试验通过对国内猪圆环病毒2型流行毒株的序列测定并结合猪圆环疫苗毒株序列，结合计算机辅助进行猪圆环抗原位点的分析预测，对可能的抗原位点肽段进行化学合成。进而，通过血清学试验对这些候选多肽抗原进行筛选，得到免疫原性较高的肽段。将这些肽段作为包被抗原建立ELISA抗体检测方法。通过120份PCV2阳性血清筛选，选取出4条肽混合作为包被抗原。进一步试验可见本方法敏感性为95.0%，特异性为97.5%，重复性稳定性好。另外目前猪圆环病毒2型阻断ELISA抗体检测方法是猪圆环ELISA抗体检测的标准方法，标准编号：GB/T 35910—2018[12]，但这一试剂盒暂未商品化。而猪圆环病毒2-dCap-ELISA抗体检测试剂盒(锐捷)是经农业农村部批准的商品化试剂盒，市场应用效果较好。此外，另一个检测方法中的PCV2 Cap蛋白与标准方法中的Cap蛋白是同一蛋白，因此本方法选取这2个方法进行符合率试验。经试验比对，本方法与Cap-ELISA方法符合率为91.5%，与猪圆环病毒2-dCap-ELISA抗体检测试剂盒(锐捷)符合率为94.6%，符合检测要求，可用于猪PCV2 ELISA抗体检测。本试验方法的建立为PCV2抗体检测提供了一种新方法，也为进一步研发相应试剂盒提供了科学依据。同时也应看到，目前猪圆环病毒相关ELISA抗体检测试剂盒还不能有效对自然感染和疫苗免疫进行鉴别。有研究者对这一问题进行了研究，陈清清等以大肠杆菌表达的PCV2 Rep蛋白为包被抗原，建立PCV2 Rep抗体检测的间接ELISA方法，能检测出PCV2全病毒疫苗免疫以及接种PCV2活毒的猪血清中的Rep抗体，而不能与PCV2亚单位疫苗免疫猪血清中的抗体发生免疫结合反应，血清学交叉试验显示Rep-ELISA具有良好的特异性，能有效鉴别自然感染或全病毒灭活疫苗免疫猪与亚单位疫苗免疫猪[13]。因此PCV2 诊断检测的下一个方向可以是对感染PCV2病毒和疫苗免疫进行鉴别诊断，为猪场净化PCV2提供支持。