Wnt/β-catenin通路相关分子在多囊卵巢综合征患者卵巢颗粒细胞中的表达

劳凯雪 刁兴华 黄 盈 刘春娇 李清春 丁培辉 姜建喜 王雁林

滨州医学院附属医院生殖医学中心 山东 滨州 256603

多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是育龄期女性常见的生殖内分泌代谢紊乱性疾病，也是导致女性排卵障碍性不孕的重要原因[1]。目前研究发现PCOS疾病是多因素共同作用的结果，包括内分泌紊乱[2]、机体慢性炎症[3]、遗传因素[4]以及不良心理情绪等。PCOS患者常表现为卵巢早期卵泡发育过多，但卵泡因发育停滞而无优势卵泡形成[5]，是一种原发性的卵泡病。颗粒细胞凋亡是导致卵泡闭锁的直接重要原因[6]，也是PCOS卵泡发育异常的重要原因之一。颗粒细胞凋亡达10 %以上的发育卵泡提示该卵泡已经或正在发生闭锁，一旦卵泡发生闭锁，便无法再回到正常发育轨道上[5]。

有研究证实，Wnt通路在调节卵巢发育、卵泡生长等方面都起到重要的作用[7]，尤其是Wnt/β-catenin信号通路。Wnt信号通路对胚胎期小鼠卵巢发育具有重要作用[8]，Wnt4-/-雌性小鼠卵母细胞数量急剧下降至不到10%，卵巢发育不良且生殖能力降低[9]，敲除Wnt4相关分子RSPO1可导致大多数雌性小鼠不孕[10]。运用基因芯片技术检测发现，突变型小鼠卵巢中Wnt/β-catenin信号通路相关拮抗基因如Wif1、Nkd1以及Dkk4仅在卵泡样病变部位的细胞中表达升高[11]，缺乏β-catenin的小鼠则卵巢发育不良[12]。前颗粒细胞的更新也依赖于支持细胞群体中的Wnt/β-catenin信号传导[13]。Foxo3a作为叉头框蛋白家族中的成员，可被Wnt通路激活[14]，并通过调控其下游P27、Cyclin D1、Puma、caspase3等信号分子影响颗粒细胞的增殖、凋亡功能[15-16]。本研究通过体外分离人卵巢颗粒细胞以探讨Wnt/β-catenin/Foxo3a信号通路在多囊卵巢综合征患者卵巢颗粒细胞异常中的调控机制。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取在我院生殖医学中心接受体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET)或卵胞浆内单精子显微注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)助孕治疗的35例患者为研究对象。将患者分为PCOS组(20例)和对照组(15例)。PCOS组采用鹿特丹诊断标准，符合以下3项中的2项即可诊断PCOS：①稀发排卵或者无排卵;②一侧或者双侧卵巢表现为多囊样改变;③雄激素增高或者有高雄激素的临床表现。入组患者还需排除其他疾病患者，如库欣综合征、先天性肾上腺皮质增生、服药导致高雄激素血症等。对照组为单纯输卵管性不孕且卵巢储备功能正常的患者。

1.2 颗粒细胞的分离与纯化 采用Percoll密度梯度离心法，将收集的卵泡液离心后胰酶消化5 min，PBS缓冲液洗涤，弃上清后用PBS缓冲液重悬颗粒细胞，缓慢平铺于等体积50% Percoll液上，2 000 r/min离心20 min。吸净白膜层，PBS缓冲液洗涤后，2 000 r/min离心5 min，弃去上清，所得沉淀即为颗粒细胞。

1.3 实时定量PCR 按照RNA-FAST试剂盒(Takara公司)说明书提取颗粒细胞总RNA，将获得的RNA逆转录成cDNA。按照SYBR Green PCR试剂盒(Takara公司)说明书将cDNA、SYBR Premix Ex Taq II(2×)、引物及dH2O混合至20 μL反应体系。使用CFX 96实时定量PCR检测仪(美国Bio-Rad公司)检测，扩增条件为95℃预变性30 s，95℃变性5 s，60℃退火30 s，如此40个循环，于60℃～95℃生成溶解曲线，每个基因设置3个复孔，以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。实验所用引物序列见表1。

表1 PCR引物序列

2 结果

2.1 卵巢颗粒细胞中的β-catenin、Foxo3a表达水平 本研究采用实时定量PCR技术检测了PCOS组与对照组卵巢颗粒细胞中β-catenin、Foxo3a的表达水平，通过对比发现，与对照组相比，PCOS组的β-catenin、Foxo3a的表达水平均升高，P<0.05,见图1。

两组比较，*P<0.05

2.2 卵巢颗粒细胞P27、Cyclin D1表达情况 为明确Foxo3a分子在PCOS患者卵巢颗粒细胞增殖中的作用，本研究检测了Foxo3a下游分子P27、Cyclin D1的表达水平。结果显示，与对照组相比，PCOS组患者卵巢颗粒细胞中P27的表达水平升高，P<0.01，见图2A，而两组颗粒细胞的Cyclin D1表达水平差异无统计学意义，见图2B。

两组比较，**P<0.01

2.3 卵巢颗粒细胞中Caspase3、Caspase8表达水平 为探索PCOS卵巢颗粒细胞凋亡情况，本研究检测了PCOS组和对照组卵巢颗粒细胞Caspase3和Caspase8的表达水平。结果显示，与对照组相比，PCOS组的Caspase3、Caspase8表达水平均高于对照组，P<0.05，见图3。

两组比较，*P<0.05

3 讨论

PCOS是育龄期妇女常见的内分泌紊乱性疾病，在育龄期妇女中发病率为5.6%[17]，在无排卵不孕症女性中占60%[18]。PCOS伴随代谢和生殖轴激素分泌的异常，为一种原发性卵泡病，卵巢颗粒细胞的异常是PCOS疾病卵泡发育异常的重要原因[19]。有研究证实，PCOS患者卵泡发育过程中存在闭锁以及颗粒细胞层退化、变薄的情况[20]。由于卵巢颗粒细胞与卵细胞关系密切，颗粒细胞的异常可导致对卵泡细胞的营养支持、调节功能障碍，影响雌二醇、孕酮的分泌，从而对卵泡的整个发育过程造成影响[5]。

有研究证实，Wnt通路在动物生长发育、细胞代谢和干细胞维持等方面发挥着重要作用[21]， 并参与了卵巢颗粒细胞的增殖、凋亡及分泌功能的调控[15-16]。Wnt通路作为一种高度保守的信号通路，在细胞内至少有三条[22]：β-catenin途径、平面细胞极性通路和钙离子通路[23-24]，其中与生殖密切相关的为Wnt/β-catenin信号通路[23]。Wnt通路激活后，Wnt与受体Frizzled和LRP5/6结合，激活Dsh磷酸化，从而传递信号至细胞内，抑制APC、GSK-3D、Axin和β-catenin形成的复合物激酶活性，使胞质内β-catenin表达升高，向细胞核内移位，与转录因子TCF/LEF家族形成复合物，启动Cyclin D1、c-myc等靶基因的转录，从而影响细胞功能[14]。本研究发现PCOS组卵巢颗粒细胞β-catenin分子表达升高，提示Wnt经典途径参与了PCOS卵巢颗粒细胞异常机制的调控。有研究表明，作为叉头框蛋白家族中成员的Foxo 3a被Wnt通路激活后能明显促进人卵巢颗粒细胞的凋亡、抑制细胞增殖，而Wnt通路抑制剂作用效果相反[14]。Foxo3a被活化后可改变细胞核内P27和Cyclin D1的表达以调控细胞周期，抑制细胞增殖[14-15]。Foxo 3a还可通过调控前凋亡蛋白Bim、FasL、Puma等凋亡分子以激活凋亡蛋白酶Caspase3和Caspase8，导致细胞凋亡[16]。目前研究表明，细胞凋亡有两条信号传导途径，包括内源性凋亡通路和外源性死亡受体通路[25-26]。本文研究发现PCOS组颗粒细胞Foxo 3a表达升高，其下游调节细胞周期的P27及凋亡相关分子Caspase3、Caspase8表达均升高，提示PCOS患者卵巢颗粒细胞增殖能力下降、外源性凋亡通路引起的凋亡增加，说明Wnt/β-catenin信号通路对Foxo 3a分子的调控能引起PCOS患者卵巢颗粒细胞增殖、凋亡异常，进而导致PCOS患者卵泡发育的异常。

综上所述，PCOS患者卵巢颗粒细胞异常与Wnt信号通路有关，Wnt/β-catenin/Foxo 3a轴为治疗PCOS疾病的潜在靶点，这将为PCOS疾病的治疗提供新的理论思路。