高表达活化白细胞黏附因子对AZ-521胃癌细胞系增殖能力的影响

潘琼 谷见法 刘松格 杨晓瑞

（郑州市中心医院肿瘤内科，河南 郑州 450007）

目前胃癌的主要治疗方式为手术切除，早期胃癌患者术后5年生存率可达90%以上，但因胃癌早期临床症状不明显，多数胃癌患者在确诊时已处于中晚期，治疗效果不尽人意[1]。活化白细胞黏附因子（Activated leukocyte cell adhesion molecule，ALCAM），即CD166是免疫球蛋白超家族成员之一，广泛存在于各组织器官，通过黏附作用介导细胞间的相互作用，参与多种生理过程以及肿瘤发生发展[2-3]。研究显示 CD166在胃癌组织中呈高表达状态[4]，但如何影响胃癌的发生尚不清楚。

故本文探讨CD166对AZ-521胃癌细胞系增殖能力的影响，以期为进一步探讨其参与胃癌发生、发展的分子机制提供初步的依据。

1 材料与方法

1.1 材料

裸鼠（6-8 w）购自北京维通利华实验动物有限公司；总RNA提取试剂盒和逆转录试剂盒购自天根生物有限公司；2×SYBR Green qPCR Mix购自美国BIO-RAD公司；cDNA反转录试剂盒购自日本TAKARA公司；DMEM培养基和胎牛血清购自美国Invitrogen公司；兔抗人CD166兔多克隆抗体购自美国Abcam公司；β-actin单克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司；HRP标记的羊抗兔二抗购自北京中山金桥生物有限公司；CCK-8试剂盒检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所。

1.2 细胞培养

人胃癌细胞株 AZ-521购自南京科佰生物科技有限公司，接种于含10%胎牛血清、1%青链霉素的高糖DMEM培养基中，于37℃，5%CO2恒温箱中培养并传代。

1.3 慢病毒包装

pLOX-CWBmi1-CD166慢病毒质粒由上海吉凯基因化学技术有限公司构建。将pLOX- WBmi1（15 μg）慢病毒空载体与pLOX-CWBmi1-CD166（15 μg）慢病毒重组载体分别与辅助质粒psPA X2（9.6 μg）和 Pmd2.G（5.4 μg）加入 600 μL pti-MEM中，取20 μL lipofectamine 200加入另一管600 μL Opti-MEM中混匀，静置5 min，两管Opti-MEM混合，室温孵育20 min，转染6 h后换液。48 h后加Puromycin（1 g·kg-1）筛选阳性细胞，同时设等密度对照细胞进行筛选。待对照 AZ-521细胞全部死亡后，感染细胞采用胰酶消化，并进行稀释、克隆，待单克隆形成后，采用荧光定量PCR和Western blot进行测定。

1.4 荧光定量PCR测定CD166 mRNA表达水平

根据 CD166的 mRNA序列，设计荧光定量PCR 引物，CD166-F：5’-GATCTCCGCCACCGTCTTCA G-3’；CD166-R: 5’-CGTCGTACTGC ACACT TTTC-5’。合成的引物稀释为10 nM。收集对照细胞和CD166过表达细胞，采用RNA提取试剂盒和逆转录试剂盒提取RNA并逆转录为cDNA。然后按照下列体积建立 PCR 体系：2×SybGreen mix 10 μL, CD166-F/R 各 0.6 μL，cDNA 8.8 μL，总体积 20 μL。根据需要配置合适的体系，加入荧光定量PCR板中，在下述反应条件下进行PCR：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，58℃退火30 s，循环数40次，PCR结束后建立溶解曲线，分析两组mRNA水平。

1.5 Western blot分析CD166蛋白水平

收集对照细胞和CD166过表达细胞，加入1×上样缓冲液，沸水煮20 min，将样本测蛋白浓度后，取50 μg总蛋白上样电泳，取出凝胶切取目的条带，用蒸馏水冲洗，结束后将蛋白转移至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉封闭30 min后，用CD166兔多克隆抗体在 4℃孵育过夜，次日用PBST洗涤 3次，每次 5 min，结束后用羊抗兔HRP标记的抗体在室温孵育1 h，结束后PBST洗涤3次，每次5 min，然后显影观察CD166蛋白表达情况。

1.6 CCK-8检测细胞增殖

分别将处于对数生长期的 AZ-521对照细胞和CD166过表达细胞用胰蛋白酶消化后，接种于96 孔板中（8×103个·mL-1，每孔 100 μL），分别继续培养12、24和48 h。待细胞贴壁后，每孔加入10 μL CCK-8工作液，继续培养4 h后测定450 nm处吸光值。每个时间点设置3个复孔。

1.7 克隆形成测定

将处于对数生长期的 AZ-521对照细胞和CD166过表达细胞用胰蛋白酶消化后，分别取100个克隆接种于6孔板中，放置37℃培养箱中继续培养，每隔2 d更换一次培养基。至第12 d时细胞克隆基本形成。弃培养基，经PBS洗涤后，室温下甲醇固定10 min，清洗、风干后加入结晶紫染色液染色20 min。计数每皿细胞中50个细胞以上的克隆数目，每种细胞设置3个复孔。

1.8 动物肿瘤模型建立

将46只BALB/c雄性裸鼠（18～23 g）随机分为对照组和CD166组（n=23），持续通过3.0%异氟烷气体和30%氧气混合进行吸入麻醉诱导后，均于小鼠左侧腋下分别接种对照细胞、CD166过表达细胞，每日观察并统计小鼠的成瘤状况、肿瘤体积以及存活时间，连续统计30 d。

1.9 统计学分析

采用SPSS19.0统计学软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±SD）的形式表示，组间样本比较采用t检验；计数资料以率（%）来表示，组间比较采用χ2检验。P＜0.05表示样本间差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 过表达CD166胃癌AZ-521细胞株构建

pLOX-CWBmi1-CD166慢病毒质粒感染后，AZ-521细胞中CD166蛋白的表达水平显著升高(P＜0.05)，见图1。

图1 Western Blot测定CD166蛋白水平

2.2 过表达CD166对胃癌AZ-521细胞增殖的影响

经慢病毒感染胃癌AZ-521细胞12 h、24 h、48 h后，细胞数量均明显增加 (P＜0.05)，但过表达CD166胃癌AZ-521细胞在各时间点的增殖活力均明显高于对照组细胞 (P＜0.05)，见图2。

图2 CCK-8测定细胞增殖能力

2.3 吉姆萨染色检测CD166过表达细胞克隆形成

与对照组细胞克隆形成数比较，CD166过表达细胞的克隆形成数明显升高 (P＜0.05)，见图3。

图3 细胞克隆形成

2.4 动物模型成瘤情况

肿瘤建模对照组小鼠死亡率为4.35%，CD166组小鼠死亡率为8.70%，均建模成功，见表1。CD166组小鼠的肿瘤生长速度明显快于对照细胞系 (P＜0.05)，见图4。

图4 小鼠肿瘤体积测定

表1 两组小鼠死亡、存活情况对比（例（%），n=23）

3 讨论

CD166属于免疫球蛋白家族中的单链跨膜糖蛋白，是淋巴细胞抗原CD6的配体，广泛分布于活化的白细胞、内皮细胞、单核细胞、神经元、造血干细胞、间叶组织干细胞等多种细胞中，参与机体的细胞黏附、造血、炎症以及系统发育等多种生物学过程[5]。近年研究显示，CD166参与多种肿瘤的发生及发展，对肿瘤细胞的生长和转移具有调控作用[6-7]。目前发现，CD166在恶性黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌、结直肠癌以及乳腺癌中呈高表达状态，并与肿瘤的生长和浸润侵袭密切相关[8-9]，但尚未见胃癌组织中 CD166蛋白的研究。

本文研究发现，稳定表达CD166蛋白的AZ-521细胞的增殖速度明显增加，细胞形成克隆率更高，在动物成瘤实验中，CD166组小鼠成瘤体积显著大于对照组小鼠同期的肿瘤体积，这表明过表达 CD166与肿瘤细胞的增殖存在密切的关系。这与文献报道一致，即CD166表达于多种肿瘤细胞和肿瘤干细胞，在前列腺癌、乳腺癌、食管癌等多种恶性肿瘤的发生发展中起着积极的作用，并与多种临床病理指标及预后相关[10]。

已有研究证明 CD166可能是通过以下途径促进肿瘤发生和浸润侵袭的：CD166可促进前体MMP（基质金属蛋白酶）-2向活化MMP-2的转变，而 MMP-2在细胞外基质和基底的降解中起着重要作用，细胞外基质的加速降解又促进了肿瘤的浸润转移[11]。但也有研究表明在某些肿瘤中CD166表达下调，可降低细胞的黏附能力以及能动性，从而促进肿瘤的远处转移[12]。因此CD166在不同肿瘤发生发展中所扮演的角色仍需进一步的研究和探索。

综上所述，CD166高表达可促进胃癌细胞的增殖活力及生长速度，并显著加速胃癌肿瘤的发生进程。这可能为未来胃癌肿瘤的早期鉴定、治疗及预后提供一定的参考价值。