PUMA 在卵巢衰老中的作用研究进展#＊

陈郅瑶 吕梦丹 张怡 张晗 郭燕君

（嘉兴学院医学院，浙江 嘉兴 314001）

女性生殖衰老是由卵巢衰老引起的，出生时卵巢原始卵泡池中卵母细胞数量是女性未来生育能力和卵巢内分泌功能的关键决定因素。雌性哺乳动物生殖的基本功能单位是卵泡，而原始卵泡则是卵泡发育的起点。

在大多数哺乳动物物种中，原始卵泡的形成与数量决定发生在出生前或新生阶段。如果原始卵泡供应过早枯竭，出生后也不可能制造新的原始卵泡[1]。研究发现，在化疗药物的作用下，原始卵泡由于其基因组完整性受到破坏而大量减少。这可能是由于化疗药物通过 PI3K/AKT/FOXO3a信号通路加速了原始卵泡的激活和成熟，最终耗尽原始卵泡的卵巢储备[2]。这也是导致卵巢早衰和不孕的可能原因。颗粒细胞可为卵母细胞提供营养和促成熟调节因子，保证卵母细胞发育成熟，在卵母细胞成熟过程中它能通过自身的抗氧化系统保护卵母细胞免受氧化应激损伤[3-4]。颗粒细胞凋亡是卵泡内的一种生理现象，可引起卵泡闭锁及卵泡数量减少[5]。因此，卵巢颗粒细胞的凋亡是导致卵巢早衰的主要病因之一。

PUMA是 2001年发现的一种促凋亡基因，其编码蛋白是一种仅含一个BH3结构域的Bcl-2相关蛋白家族蛋白[6]，也称为BBC3（Bcl-2 binding component3），因其可以被p53快速诱导转录及其编码的蛋白具有强大促凋亡作用而得名[7]。PUMA的主要生理功能是诱导受损或应激的细胞凋亡，参与调节卵巢衰老生理过程。本文综述PUMA的生物学活性和调控卵巢衰老的机制。为延长生殖寿命和提高生育能力奠定基础。

1 PUMA的结构与功能

PUMA基因（19q13.3）导致促凋亡BH3蛋白的表达。PUMA转录本的长度约为1.6～1.9 kb，PUMA基因具有4个外显子和三个内含子，转录后形成四种不同的剪接体（PUMA-α、PUMA -β、PUMA -γ及PUMA -δ），只有含有BH3结构域的PUMA α和PUMA β显示促凋亡活性。它们可以与线粒体膜中的 Bcl-2家族成员相互作用，驱动细胞色素C从线粒体重新定位到细胞质中。除了含有BH3结构域的蛋白质外，PUMA与其他已知蛋白质没有显著的同源性。人和小鼠PUMA序列的比对表明约90%的同一性[8-10]。

PUMA位于线粒体外膜，通过直接或间接抑制抗凋亡 Bcl-2家族成员而启动凋亡，这种相互作用减轻了线粒体膜对促凋亡Bax/Bak基因的抑制作用，从而导致细胞色素C释放，凋亡小体形成，Caspase激活以及随后的细胞破坏。PUMA介导由细胞核和细胞质p53诱导的细胞凋亡。还驱动由p53非依赖性信号诱导的凋亡，如生长因子剥夺或暴露于糖皮质激素或佛波酯。

2 PUMA调控卵巢衰老的机制

2.1 调节小鼠生殖细胞丢失和原始卵泡发育

最初在卵巢内建立的原始卵泡的数量受胚胎卵巢发育过程中生殖细胞死亡程度的影响，但机制尚未完全揭示。Myers等人研究发现，PUMA是卵巢发育过程中决定生殖细胞数量的关键决定因素[11]。早在胚胎第13.5天，Puma基因的靶向敲除就显示出生殖细胞数量的显著增加。在之后的胚胎阶段和出生后早期，Puma-/-雌性小鼠的生殖细胞数量与WT雌性小鼠相比保持升高，出生后第 10天卵巢中原始卵泡数量增加 1.9倍。但在Puma-/-雌性的卵巢中观察到的生殖细胞数量的增加并非由于卵巢中生殖细胞增殖活性的改变。研究还显示 PUMA是生殖细胞死亡的关键调节因子，在卵子发生的迁移阶段或生殖细胞到达性腺后不久起作用，PUMA介导的细胞死亡限制了最初卵巢储备中建立的原始卵泡的数量[11]。因此PUMA基因的缺失可保护卵巢储备，并保持生育能力。但PUMA基因的缺失不会影响到生殖细胞巢破裂时大量生殖细胞丢失的发生。

2.2 调控卵泡闭锁

颗粒细胞凋亡是卵泡闭锁的潜在机制之一。活性氧（Reactive oxygen species，ROS）在卵泡发育和存活中起重要作用。柠檬酸循环中形成的副产物ROS可能通过与细胞中的脂质、蛋白质和核酸相互作用而引起氧化损伤。当细胞内调节氧化和还原过程之间的平衡被破坏，并且细胞无法修复由此产生的氧化损伤时，增加的ROS会诱导细胞发生氧化应激[12]。与年龄相关的卵母细胞质量和生育能力下降都是由氧化应激调节的[13]，且氧化应激也促进颗粒细胞凋亡[14]。颗粒细胞对活性氧敏感。尽管内源性H2O2是重要的信号分子，但高水平的H2O2可能会导致细胞功能障碍和细胞死亡，含H2O2的ROS在颗粒细胞凋亡中起关键作用。

研究表明 H2O2可以诱导卵巢颗粒细胞凋亡[15]，包括降低抗凋亡分子（如 Bcl-2，Bcl-xL和Mcl-1）的表达，以及增加促凋亡因子（如 Bax，Bak和PUMA）的表达。实验证明过表达puma可加强H2O2诱导的颗粒细胞凋亡，而敲除puma基因会显著降低了这种细胞凋亡，由此确认PUMA是颗粒细胞凋亡的参与者。由于PUMA直接诱导Bax和Bak的逐步激活，故PUMA上调会导致颗粒细胞凋亡。另一方面，过表达的Bcl-xL可抑制H2O2诱导的颗粒细胞凋亡[28]。此外，Bax和Bak的自主活化可以独立于激活剂BH3s，下调Bcl-2、Bcl-xL和Mcl-1[29]。因此，H2O2诱导的颗粒细胞凋亡机制是由于 Bax和 Bak的激活，通过增加PUMA和减少抗凋亡因子Bcl-2、Bcl-xL和Mcl-1来介导的。这些结果均提示抑制PUMA可能提高颗粒细胞的存活率，对卵巢颗粒细胞凋亡相关的卵泡闭锁有有益的作用。

2.3 诱导 DNA损伤原始卵泡卵母细胞凋亡和生育力丧失

研究发现PUMA和NOXA对DNA损伤诱导的转化相关蛋白63（Transformation-related protein 63，Trp63）介导的原始卵泡卵母细胞凋亡至关重要。Trp63是一种与肿瘤抑制因子 p53相关的转录因子，属于原始卵泡卵母细胞细胞核中主要的Trp53家族成员，对体内DNA损伤引发的细胞凋亡至关重要。γ射线照射后，在成年野生型和Trp53-/-小鼠的原始卵泡卵母细胞中只观察到促凋亡成员Puma和Noxa的诱导，而在Trp63缺陷小鼠中未观察到Puma和Noxa的诱导。Puma缺陷或Puma和Noxa缺陷的小鼠的原始卵泡卵母细胞被保护免受γ射线辐射诱导的凋亡，并且可以产生健康的后代[16]。DNA损伤诱导Trp63介导的原始卵泡卵母细胞凋亡机制总结如图1所示。

图1 DNA损伤诱导Trp63介导的原始卵泡卵母细胞凋亡机制

诱导凋亡的DNA损伤导致Trp63的激活，PUMA和NOXA的直接的或间接的转录诱导，随后PUMA和NOXA蛋白与促存活的BCL-2家族成员（BCL-2、BCLXL、BCL-W、MCL-1）结合，也可能是 PUMA与 BAX/BAK的直接结合激活BAX和BAK，导致卵母细胞凋亡。

2.4 PUMA缺失可保护卵巢储备免受化疗药物的损伤

Quynh等人使用基因缺失小鼠模型来研究DNA损伤诱导的促凋亡蛋白PUMA及其转录激活因子Trp63在环磷酰胺或顺铂治疗引起的原始卵泡衰竭中的作用[17]。环磷酰胺几乎完全破坏了成年野生型小鼠的原始卵泡池，顺铂也被观察到了显著的破坏作用。与此形成鲜明对比的是，Puma-/-小鼠在任何一种基因毒性治疗后都保留了100%的原始卵泡。

此外，仅敲除PUMA就完全保持了环磷酰胺处理小鼠的生育能力，研究表明从 DNA损伤诱导的死亡中拯救出来的卵母细胞可以自我修复，足以支持生殖功能和后代健康。顺铂治疗后Trp63-/-小鼠的原始卵泡也得到保护，但环磷酰胺治疗后 Trp63-/-小鼠的原始卵泡没有得到保护。PUMA转录激活的途径可能不同，顺铂激活Trp63依赖的过程，而环磷酰胺通过Trp63非依赖的途径起作用。研究表明不同化疗药物诱导的DNA损伤中，诱导凋亡和卵巢储备减少的机制不同，PUMA是细胞凋亡的关键效应物，PUMA导致暴露于环磷酰胺或顺铂后原始卵泡的衰竭，抑制PUMA可能是妇女癌症治疗期间有效的卵巢保护策略。环磷酰胺和顺铂诱导 DNA损伤而导致卵母细胞凋亡的分子途径总结如图2所示。

图2 环磷酰胺和顺铂诱导DNA损伤后卵母细胞凋亡的途径

顺铂引起的DNA损伤激活了一条信号通路，其中Trp63起着关键的调节作用，下游转录诱导Puma，最终导致凋亡效应物BAX和BAK的释放。环磷酰胺诱导的 DNA损伤激活了一种不需要Trp63的替代信号通路；可能的介质是FOXO3a或p53。实心箭头表示已知路径。虚线箭头表示可能的替代路径。

4 总结与展望

综上所述，PUMA是卵巢发育过程中生殖细胞数量和原始卵泡发育的关键决定因素，抑制PUMA可能通过提高颗粒细胞的存活率来减少卵泡闭锁，PUMA是Trp63诱导的原始卵泡凋亡的关键效应物。然而，PUMA与生殖细胞数量、原始卵泡的发育和颗粒细胞凋亡三个方面的机制尚未清楚，仍有待进一步研究。特别是卵巢癌化疗方面，破坏 DNA的癌症化疗治疗会耗尽原始卵泡的卵巢储备，导致卵巢早衰和不孕。进一步探索 PUMA在卵巢癌化疗驱动的卵泡丢失的确切机制将有利于促进靶向卵巢保护剂的发展。在癌症治疗期间通过阻断Puma来保护女性生育能力，对于防止过早绝经、改善女性健康、和为人类生殖临床提供理论基础方面将有着积极的意义。