基于层次分析法多指标优选三方益子方的水提工艺

随家宁，陈海燕，冯婷，李芳婵*，蒋林，2，3*，黄婉清，农丽惠（.广西中医药大学，南宁 530200；2.广西壮瑶药工程技术研究中心，南宁 530200；3.广西高校中药制剂共性技术研发重点实验室，南宁 530200）

三方益子方由三个古代经典名方加减化裁而来，由盐益智、盐补骨脂、乌药、金樱子、酒覆盆子、酒黄精、枸杞子、桑葚、芡实、酒苁蓉和炙甘草11味药组成，具有暖肾祛寒、温脾养肝、缩尿止遗的功效。临床以汤剂应用多年，疗效明显，由于复方成分复杂，为保证临床应用汤剂能充分发挥出原有的临床疗效和安全性，将古人的临床用药经验与现代工艺技术相结合[1]，即以水为溶媒提取，确保安全性和临床疗效的一致性[2]。

目前“整体观思想”是破解中药质控碎片化，突破重围的重要指导[1]，采用多指标成分评价提取工艺可满足本方物质基础的整体性[3]。中药复方有“多成分、多靶点”的特点，为遵循复方制剂“整体”概念，借鉴特征图谱分析手段，可较好地体现复方中各类成分与疗效的相关性。得膏率和药效成分是中药提取最常用的评价指标[3]，药效成分是药物发挥临床疗效的物质基础，最大限度地提取药效成分可保证临床疗效及提高用药效率[4]。因此选择特征图谱、主要药效成分、得膏率为考察指标，确定各项工艺参数。另外，对多指标合理的综合评价，直接影响着提取工艺参数的确定，各个评价因素的权重系数的确定又是科学、合理地作出评价的基础[5]，层次分析法（AHP）是一种主观结合客观的评价方式，经其确定各指标的权重增强了评价结果的合理性和科学性。

故本研究在传统水提取的基础上，对三方益子方有效组分进行提取工艺优选并验证，得到最佳提取工艺参数，为处方的制剂工艺奠定基础。

1 材料

1.1 仪器

高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司，型号：Anglient 1260 Ⅱ）；超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司，型号：KQ-500E）；SQP分析天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司）；超纯水仪一体机（广西南宁市博美生物科技有限公司，型号：Direct-Q5UV）；真空干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司，型号：DZF-6090）。

1.2 试药

盐益智（Alpinia oxyphyllaMiq.）、盐补骨脂（Psoralea corylifoliaL.）、乌药（Lindera aggregata（Sims）kosterm.）、酒 黄 精（Polygonatum sibiricμmRed.）、酒覆盆子（Rubus chingiiHuu）、金樱子（Rosa LaevigataMichx.）、枸杞子（Lycium barbarumL.）、桑葚（MorusalbaL .）、芡实（Euryale feroxSalisb.）、酒苁蓉（C.tubulosa（Schenk）Wight）、炙甘草（Glycyrrhiza uralensisFisch）均购自南宁市华泰中药饮片有限责任公司，均由广西中医药大学朱意麟老师鉴定为正品；原儿茶酸（批号：RP190605，纯度≥99.99%）、补骨脂素（批号：RP190515，纯度≥99.99%）、异补骨脂素（批号：RP190423，纯度≥99.95%）、甘草酸（批号：RP190517，纯度≥99.34%）（成都麦德生科技有限公司）；乙腈（色谱级，美国Thermo Fisher Scientific公司）；磷酸（分析纯，成都金山化学试剂有限公司，批号：20190606）；甲醇（分析纯，成都市科隆化学品有限公司，批号：2020102902）。

2 方法与结果

2.1 水提浓缩液样品的制备

按照处方比例的5倍量称取处方药材，按8倍、6倍、6倍加水量，2 h、1 h、1 h的提取时间，提取3次，合并药液，浓缩至500 mL，置于4℃冰箱保存，备用。

2.2 特征图谱研究

2.2.1 色谱条件 采用Agilent 5 TC-C18（2）（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱；以乙腈（B）-0.2%磷酸（A）为流动相；梯度洗脱（0～5 min：5%～7%B；5～12 min：7%～15%B；12～26 min：15%～40%B；26～35 min：40%～50%B；35～45 min：50%～85%B；45～60 min：85%B），流 速1.0 mL·min－1，柱 温30℃；进样量10 μL；检测波长（0～18.5 min：260 nm；18.5～21 min：300 nm；21～30 min：350 nm；30～60 min：252 nm）。

2.2.2 供试品溶液的制备 取“2.1”项下样品5 mL于蒸发皿中，挥干，精密加入25 mL甲醇转移至锥形瓶中，称定重量，超声30 min，待冷却后，再称定重量，用甲醇补足减少的重量，即得。

2.2.3 各单味药溶液的制备 按处方比例称取各单味药，按“2.2.2”项下方法制得各单味药材供试品溶液。

2.2.4 特征图谱的建立及相似度评价 按照“2.2.1”项下色谱条件，按“2.2.2”项下方法制备10批次供试品溶液进行测定，记录图谱。将10个图谱导入“中药色谱特征图谱相似度评价系统”（2012年版），以S1为参照图谱，时间窗宽度为0.1 s，通过多点校正后，采用中位数相关系数法进行图谱自动匹配，生成10批次样品共有模式图谱，确定了19个共有峰，并建立对照图谱（R），结果见图1，计算相似度，结果见表1。10批三方益子方的相似度均在0.982以上，表明不同批次间样品相似度良好。

表1 相似度评价结果(n＝10) Tab 1 Similarity evaluation (n＝10)

图1 10批样品HPLC色谱叠加图Fig 1 HPLC chromatogram stacking of 10 batches of samples

2.2.5 共有峰的分析 通过对10批样品图谱进行分析，共标定出19个共有峰，选择峰面积较大、保留时间居中且稳定性好的15号峰（补骨脂素）为参照峰，分别计算10批样品共有峰的相对保留时间和相对峰面积，见表2和表3，表明不同批次间制备的三方益子方相应色谱峰的峰面积存在差异。

表2 10批供试品19个共有峰相对保留时间结果(n＝10) Tab 2 Relative retention time of 19 common peaks of 10 batches of test samples (n＝10)

表3 10批供试品19个共有峰相对峰面积结果(n＝10) Tab 3 Relative peak area of 19 common peaks of 10 batches of samples (n＝10)

2.2.6 共有峰的归属及指认 将供试品溶液和处方中各单味药溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样，记录图谱，见图2。与对照图谱进行比较，其中盐益智含有3、4、5号峰，补骨脂中含有8、9、15、16、18、19号峰，乌药中含有2、6号峰，金樱子中含有2、5、11号峰，覆盆子中含有2、11号峰，黄精中含有1、3、4号峰，枸杞子中含有1、3、4号峰，肉苁蓉中含有2、3、4、7、11、12号峰，芡实中含有2号峰，桑葚中含有2、3、4、5号峰，甘草中含有3、10、11、14、17号峰。并且用对照品比对出，3号峰属于5-羟甲基糠醛，5号峰属于原儿茶酸，7号峰属于松果菊苷，15号峰属于补骨脂素，16号峰属于异补骨脂素，17号峰属于甘草酸。

图2 共有峰的指认图Fig 2 Identification of common peaks

2.2.7 特征图谱方法学考察

① 精密度：取“2.2.2”项下供试品溶液1份，连续进样6针，结果19个峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均分别在0.010%～0.18%和0.10%～1.9%，证明仪器精密度良好。

② 重复性：按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液6份，进样测定，结果19个共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值分别为0.010%～0.50%和0.57%～2.8%，表明方法重复性良好。

③ 稳定性：取“2.2.2”项下供试品溶液1份，于0、2、4、8、12、24 h进样，结果19个共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值分别为0.030%～0.44%和0.28%～2.8%，表明样品在24 h内稳定。

2.3 三方益子方中4种成分含量测定

2.3.1 对照品溶液的制备 取原儿茶酸、补骨脂素、异补骨脂素和甘草酸对照品适量，精密称定，分别用甲醇溶解于10 mL量瓶并定容，摇匀，即得质量浓度为0.422、0.406、0.969和0.965 mg·mL－1的原儿茶酸、补骨脂素、异补骨脂素、甘草酸的对照品溶液。

2.3.2 样品及阴性样品溶液的制备 供试品溶液制备同“2.2.2”项下方法。按处方比例分别称取除盐益智、金樱子、桑葚、枸杞子外的药材，按“2.1”和“2.2.2”项下方法制备阴性样品溶液①。

2.3.3 缺补骨脂阴性样品溶液的制备 按处方比例分别称取除补骨脂外的药材，按“2.1”和“2.2.2”项下方法制备阴性样品溶液②。

2.3.4 缺炙甘草阴性样品溶液的制备 按处方比例分别称取除炙甘草外的药材，按“2.1”和“2.2.2”项下的方法制备阴性样品溶液③。

2.3.5 专属性试验 取对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样分析，结果见图3。显示原儿茶酸、补骨脂素、异补骨脂素和甘草酸4个成分的色谱峰保留时间与样品中相应的色谱峰保留时间一致，各个峰分离度、对称性较好，各阴性样品对成分测定无影响，色谱柱理论塔板数以不低于20 000为准。

图3 三方益子方提取工艺专属性试验结果Fig 3 Specificity test of the extraction process of Sanfang Yizi prescription

2.3.6 标准曲线的制备 分别精密量取“2.3.1”项下各对照品溶液适量，于5 mL量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度线，制成含原儿茶酸、补骨脂素、异补骨脂素和甘草酸质量浓度为0.041、0.0715、0.0969和0.11 mg·mL－1的 混 合 对 照品溶液，分别稀释成系列浓度线性溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录各个指标成分的峰面积，分别以峰面积（Y）为纵坐标，进样量（μg，X）为横坐标，得原儿茶酸线性回归方 程 为Y＝2.906×103X＋4.230，R＝1.000；补骨脂素为Y＝4.844×103X＋16.58，R＝1.000；异补骨脂素为Y＝6.073×103X＋29.92，R＝1.000；甘草酸为Y＝783.9X＋2.840，R＝1.000。结果表明原儿茶酸、补骨脂素、异补骨脂素、甘草酸分别在0.082～0.410 μg、0.143～0.715 μg、0.194～0.969 μg、0.22～1.10 μg内与峰面积线性关系良好。

2.3.7 方法学考察

① 精密度考察：精密吸取“2.3.6”项下混合对照品溶液10 μL，进样测定，连续进样6次，结果原儿茶酸、补骨脂素、异补骨脂素和甘草酸的平均峰面积RSD值分别为0.80%、0.60%、0.60%和0.61%，表明仪器精密度良好。

② 稳定性考察：按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，于0、2、4、8、12、24 h进样测定，结果原儿茶酸、补骨脂素、异补骨脂素和甘草酸的平均峰面积RSD值分别为0.64%、0.73%、0.49%和0.33%，表明样品在24 h内稳定性良好。 ③ 重复性考察：按“2.2.2”项下方法平行制备供试品溶液6份，进样测定，结果原儿茶酸、补骨脂素、异补骨脂素和甘草酸的平均峰面积RSD值分别为2.3%、1.9%、1.9%和2.8%，表明方法重复性良好。

④ 加样回收率：精密吸取“2.1”项下样品2.5 mL，共6份，分别精密加入新配制的质量浓度为0.95、1.049、1.057、0.53 mg·mL－1的原儿茶酸、补骨脂素、异补骨脂素、甘草酸对照品溶液适量，平行制备供试品溶液6份，进样测定。结果原儿茶酸、补骨脂素、异补骨脂素和甘草酸的平均加样回收率分别为100.58%、102.73%、98.83%和101.78%，RSD值 分 别 为1.4%、1.6%、2.0%和1.4%。

2.4 正交试验优化三方益子方最佳提取工艺

2.4.1 综合评分计算公式[6-7]

其中，A为特征图谱峰面积和，A＝A1＋A2＋……＋A19；B为原儿茶酸；C为补骨脂素；D为异补骨脂素；E为甘草酸；F为得膏率；Wi为指标权重系数。

其中，m为干膏重，M为药材重。

其中，i为指标，αi为指标评分数，m为受检验目标层次数。

其中，CR为一致性比例因子；RI为一致性指标，具体参照表4。

表4 平均随机一致性指标RI值 Tab 4 Average random consistency index RI value

2.4.2 指标权重的确定[9]根据三方益子复方中药味的君臣佐使配伍规律、各成分药理作用强弱以及有效成分所归属的药味多少，本研究将特征图谱峰面积总和，原儿茶酸、补骨脂素、异补骨脂素、甘草酸峰面积和得膏率作为权重指标予以量化，即将6项指标分成5个层次，各层次评分标准见表5，并确定优先顺序：特征图谱峰面积总和＞原儿茶酸＞补骨脂素＝异补骨脂素＞甘草酸＞得膏率，构建优先判断矩阵，见表6。

表5 各层次评分标准 Tab 5 Grading criteria for each level

表6 指标成对比较判断优先矩阵 Tab 6 Pairwise comparison judgment priority matrix of indicators

按照“2.4.1”项下综合评分计算公式得出特征图谱峰面积总和，原儿茶酸、补骨脂素、异补骨脂素、甘草酸和得膏率的权重系数分别为0.3939、0.2372、0.1346、0.1346、0.0655、0.0343，一致性比例因子（CR）＝0.016 47＜0.10，指标优先比较判断矩阵具有满意的一致性，求得的权重系数有效。

2.4.3 正交试验设计与结果 在单因素试验的基础上，选择影响因素为提取时间（A，2 h、2.5 h、3 h）、料液比（B，1∶12、1∶14、1∶16）、提取次数（C，1、2、3次），L9（34）为正交表进行正交试验，以特征图谱峰面积总和，原儿茶酸、补骨脂素、异补骨脂素、甘草酸的峰面积，以及得膏率的综合评分为评价指标，根据“2.4.1”项下方法计算综合总评分，并进行直观分析与方差分析。因素与水平见表7，正交试验设计直观分析结果见表8，方差分析结果见表9。

表7 因素与水平表 Tab 7 Factor and level

表8 三方益子方提取正交试验直观分析结果(n＝2) Tab 8 Visual analysis of orthogonal experiment of Sanfang Yizi prescription (n＝2)

表9 三方益子方正交试验的方差分析结果 Tab 9 ANOVA of Sanfang Yizi prescription of orthogonal test

直观分析结果示3个因素的主次关系为B＞C＞A，方差分析结果表明B、C因素对综合评分结果均具有显著影响，A不显著，正交试验结果表明最佳工艺为A3B2C3，即加14倍水，提取3次，每次3 h，但结合生产成本、经济效益等因素，即最佳提取工艺为加14倍水，提取3次，每次2 h。

2.4.4 正交试验验证结果 按照最佳提取工艺提取3批药，根据建立的含量测定方法和特征图谱方法，进行测定，计算综合评分，结果表明工艺稳定，重复性好，可作为该方的水提工艺（见表10）。

表10 验证试验结果 Tab 10 Verification test

3 总结与讨论

质量标志物基于有效、特有、传递与溯源、可测和处方配伍的“五要素”为核心，既反映了与有效性（和安全性）的关联关系，又体现中药成分的专属性、差异性特征，特别是基于方-证对应的配伍环境，使质量研究回归到中医药理论，体现针对疾病的中药有效性表达方式及其物质基础的客观实质[10]。中药特征图谱现已被广泛应用于整体反映中药成分复杂性的研究中，可对某些特征成分进行指认及分析，是中药的有效质量控制与评价方法[11]。三方益子复方成分繁多复杂，采用单一指标考察工艺，一味追求个别成分含量最大，使得结果太过片面，应全面综合权衡，与现代技术特征图谱等结合，尽可能覆盖君臣佐使药材中的有效成分来反映中药复方的有效成分群体，尝试用未知的结构成分的模糊数据（特征色谱峰的总面积之和）相结合的方法，进行多指标的综合评定[12]。

三方益子方中质量标志物基于“君”药首选原则，兼顾“臣”“佐”“使”药的有效成分来筛选，君药盐益智中原儿茶酸可通过抗氧化应激作用抗氧化应激保肝[13]，尚可改善老年大鼠的认知能力，具神经保护功能[14]，且本方中臣药金樱子，佐药桑葚、枸杞子中亦含原儿茶酸成分。君药补骨脂中补骨脂素可改善肾虚的症状，提升老年人的记忆力和认知能力[15]，保护神经细胞，预防阿尔茨海默病的发生[16]，补骨脂素、异补骨脂素均可抑制小鼠前列腺增生，改善夜尿增多的症状[17]，也是治疗老年人易患疾病骨质疏松症的活性成分[18]。佐药炙甘草中甘草酸成分被用作炙甘草配方颗粒的评价指标，具有很好的改善肝脏功能的作用[19]，对各种慢性肾脏疾病具有一定的疗效，保护药物性肾脏损伤[20]，也能够促进脑功能恢复，提升老年人的记忆力和认知能力，降低阿尔茨海默病的发生[21]，尚可提高机体免疫力[22]。 多指标综合评价的方式已成为复方制剂优选提取工艺的重要手段，AHP是一种将评价指标定性与定量相结合的决策分析方法，不仅考虑了主观意识对各项指标的重视程度，又考虑了各项指标原始数据之间的相互联系及影响，增强了总体评价结果的科学性及合理性[6]。本研究采用HPLC建立三方益子水提液特征图谱，标定涵盖了11味药材的19个共有峰，建立了原儿茶酸、补骨脂素、异补骨脂素、甘草酸含量测定方法，选用共有峰总面积，原儿茶酸、补骨脂素、异补骨脂素、甘草酸和得膏率作为指标进行考察，避免了以单一指标的局限性，与中药复方的多组成、多靶点作用特点相吻合[9]。