糖尿病胫前黑斑患者TH17、Treg 的表达及其与糖尿病足的相关性研究

梁波，林家煜

福建医科大学附属第二医院内分泌科，福建泉州 362000

胫前皮肤黑斑在糖尿病中的临床发病率可高达24.78%[1]， 也有因胫前黑斑就诊才首次发现糖尿病的患者，皮肤黑斑通常密集或散在对称分布，一般呈斑点状，或融合成片状，棕褐色居多，部分暗红或褐黑色，颜色深浅不一。 一般与皮肤表面相平，可低于皮肤表面，黑斑周围皮肤可有萎缩性损害，外伤或搔抓后可出现浅表性溃疡，也可出现自发性溃疡。

随着对糖尿病慢性并发症深入研究，除了褪黑素减少、ACTH 水平升高以及下肢中小动脉粥样硬化的原因[2-4]，近些年的研究热点如氧化应激、持续低度炎症发现也与糖尿病皮肤损害有关。2 型糖尿病患者也存在细胞和体液免疫反应异常[5]，研究发现，Th17/Treg 平衡失衡与糖尿病发病密切相关[6-7]，Th17/Treg 平衡是否与2型糖尿病患者胫前黑斑及其他慢性并发症发生相关，国内外研究较少。 该研究于2017 年1 月—2020 年12月拟研究Th17/Treg 在2 型糖尿病胫前黑斑患者中的表达情况，以探讨免疫异常在糖尿病胫前黑斑患者发病的作用，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

收集于该院住院的18～65 岁（避免老年性皮肤色素沉着干扰）2 型糖尿病患者病例，纳入标准：①符合1999年WHO2 型糖尿病（T2DM）诊断标准；②无急性严重代谢紊乱如酮症酸中毒、高渗状态；③肝肾功能正常，无心脏疾病史、无高血压病史；④无自身免疫性疾病，无各种感染、肿瘤，未使用免疫抑制或增强剂。 正常对照组来源于该院健康体检人员，纳入标准：①糖耐量正常；②无心肝肾等疾病；③无影响糖代谢的相关疾病及急性应激性疾病；④无自身免疫性疾病及相关的家族史；⑤无胫前黑斑；⑥年龄、性别与T2DM 组相匹配。

将T2DM 组按照胫前皮肤有无萎缩性色素沉着斑分为有斑组与无斑组。 黑斑判断标准：绝大部分呈对称或不对称分布在膝关节以下胫前皮肤表面，呈密集或散在分布，5 点或5 点以上，形状呈斑点状或小片状，颜色棕褐色或棕黑色，且斑点周围有萎缩性皮损。

1.2 方法

1.2.1 临床资料收集 ①一般资料：性别、年龄、体质量指数[BMI=体质量（kg）/身高的平方（m2）]、糖尿病病程、血压（高血压患者不入组，高血压：有高血压病史或两次非同日血压≥140/80 mmHg）。②生化指标：糖化血红蛋白（HbA1c）、总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）。③微血管病变：眼底检查评估患者是否存在糖尿病视网膜病变；尿微量白蛋白/肌酐比值＞30 mg/g 评估患者是否存在糖尿病肾损害；神经传导速度测定评估糖尿病周围神经病。 ④下肢动脉血管彩超，评估下肢动脉粥样硬化情况。⑤糖尿病足：按Wargner 分期进行评估。⑥均留取血样，以用于体外实验。

1.2.2 标本采集与保存 采集受试对象的空腹静脉血10 mL，选取4 mL 全血置入不加抗凝剂管，自然凝血后，离心10 min，分离血清。 选取6 mL 全血置入肝素抗凝管，在30 min 内采用Ficoll 淋巴细胞分离液密度梯度离心法分标本中的外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）；收集分装后，均置－80℃冰箱保存。

1.2.3 主要试剂和仪器 流式细胞仪（FACS Calibur and Cell Quest Pro 型），小鼠抗人 CD25、CD4、Foxp3 及 IL-17A单克隆荧光抗体；莫能菌素、离子霉素和氟波酯。 人IL-17、IL-22 和 IL-10、TGF-β 的 ELISA 检测试剂盒；Multiskcan FC 酶标仪。

1.2.4 流式细胞仪检测 Th17/Treg 细胞 （1）Th17 细胞检测：①将PBMC 用常温PBS 洗涤1 次，细胞计数浓度至 2×106/mL。 ②提取 100 μl PBMC 细胞悬液，加入莫能菌素（500 ng/mL）、离子霉素（1 μM）以及氟波酯（50 ng/mL）。 ③移入 24 孔板孵育 5 h，PBS 洗涤 1 次。④加入FITC 标记的小鼠抗人CD4+单抗，4℃下孵育15 min，避光。⑤加入破膜剂孵育15 min。⑥加PE 标记的小鼠抗人IL-17A 单抗，4℃孵育15 min，避光。⑦PBS洗涤1 次，重悬细胞。 ⑧0.5%多聚甲醛固定后经流式细胞仪检测CD4+/IL-17A+细胞的比例。

（2）Treg 细胞检测：①将 PBMC 用常温 PBS 洗涤 1次，细胞计数浓度至 2×106/mL。 ②提取 100 μl PBMC细胞悬液，加入FITC 标记的小鼠抗人CD4 单抗和Per CP标记的小鼠抗人CD25 单抗，4℃下孵育15 min，避光。③加入破膜剂孵育15 min。 ④加PE 标记的小鼠抗人Foxp3 单抗，4℃孵育 15 min，避光。 ⑤PBS 洗涤 1 次，重悬细胞。 ⑥0.5%多聚甲醛固定后经流式细胞仪检测CD4+/CD25/Fox P 3+细胞的比例

1.2.5 ELISA （Enzyme linked immunosorbent assay，酶联免疫吸附测定） 测定血 IL-17、IL-22、IL-10、TGF-β 表达 ①按试剂盒说明书配置标准品工作液浓度梯度由于绘制标准曲线。②取试剂盒里的96 孔板，每孔分别加标准品或待测样品100 μl，37℃孵育90 min。③标记抗体孵育：每个孔加入生物素化抗体工作液100 μl，37℃孵育60 min。④每孔加入洗涤液350 μl 洗涤3 次。⑤每孔加入辣根过氧化物酶标记的亲和素工作液100 μl，37℃孵育30 min，洗涤5 次。⑥每孔加入底物溶液（TMB）90 μl，37℃避光孵育 15 min 显色。⑦每孔加终止液 50 μl，终止反应，在反应终止5 min 内，用酶标仪在450 nm 波长测量各孔的光密度（OD 值）。 ⑧以标准品浓度与OD值的关系绘制标准曲线，计算出直线回归方程式，通过待测样品的 OD 值， 计算出样品的浓度， 乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。 进一步比较。

1.3 统计方法

采用SPSS 22.0 统计学软件进行数据分析，各组数据均进行正态性检验。正态分布的计量资料以（）表示，两组间比较进行t 检验；非正态分布的计量资料以中位数和四分位间距表示，两组间比较采用Mann-Whitney U检验；计数资料以频数和百分比（%）表示，进行χ2检验。 所有检验方法均为双侧检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3 组受检者人口学资料分析

收集糖尿病患者167 例，男 103 例，女64 例；伴胫前黑斑患者83 例，其中糖尿病足患者36 例，无胫前黑斑患者84 例，其中糖尿病足12 例。 正常对照组80 名。

病程都＞3 年，年龄＞35 岁，但 35～50 岁的黑斑发病率与50～65 岁相当，提示糖尿病患者黑斑发生与年龄增加无关。糖尿病伴胫前黑斑组BMI 明显低于无伴胫前黑斑组，差异有统计学意义（P＜0.05），提示糖尿病患者胫前黑斑发生可能与BMI 下降相关，见表1。

表1 3 组受检者临床资料比较

2.2 3 组受检者生化指标比较

入组病例均排除肝肾功能电解质异常患者，因此该研究比较患者的血糖控制水平（糖化血红蛋白）和血脂水平的差异，评估血糖血脂对胫前黑斑发生的影响，结果显示两组患者 HbA1C、TG、TC、HDL-C、LDL-C 比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表 1。

2.3 各组患者并发症情况比较

与无伴胫前黑斑组相比，伴胫前黑斑组糖尿病患者，糖尿病视网膜病变、尿ACR 升高及糖尿病足的发生率较高，差异有统计学意义（P＜0.05），但周围神经损害、下肢动脉粥样硬化发生率比较，差异无统计学意义（P＞0.05），提示糖尿病患者黑斑发生可能与微血管病变及糖尿病足发生有关，见表1。

2.4 3 组受检者外周血Th17 细胞和Treg 细胞表达情况

糖尿病患者伴和不伴胫前黑斑组外周血中Th17 细胞比例均高于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），糖尿病伴胫前黑斑患者组和无胫前黑斑患者组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；伴和不伴胫前黑斑的糖尿病患者外周血中Treg 细胞比例均低于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），且伴胫前黑斑糖尿病患者组外周血Treg 细胞比例低于无胫前黑斑糖尿病患者组，差异有统计学意义（P＜0.05），见图 1、表 2。

图1 各组受检者外周血Th17 和Treg 细胞比例流式图

表2 3 组受检者外周血 Th17 和 Treg 细胞比例对比[（），%]

表2 3 组受检者外周血 Th17 和 Treg 细胞比例对比[（），%]

注：*代表与正常对照组对比，P＜0.05；#代表与糖尿病无胫前黑斑组对比，P＜0.05

组别Th17 Treg糖尿病伴胫前黑斑组（n=83）糖尿病无胫前黑斑组（n=84）正常对照组（n=80）（3.73±0.36）*（3.98±0.19）*1.68±0.43（3.68±0.24）*#（4.85±0.15）*6.76±0.32

2.5 3 组受检者血细胞因子表达情况比较

糖尿病患者伴和不伴胫前黑斑组受检者外周血中IL-17 的水平高于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），糖尿病伴胫前黑斑患者组和糖尿病无胫前黑斑患者组比较，差异无统计学意义；与正常组对比，两组受检者 IL-22 水平有升高，差异无统计学意义（P＞0.05）；②糖尿病患者伴和不伴胫前黑斑组受检者外周血中TGF-β、IL-10 均低于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），且糖尿病伴胫前黑斑患者组外周血TGF-β、IL-10 表达低于糖尿病无胫前黑斑患者组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表 3。

表3 3 组受检者外周血细胞因子结果比较[（），pg/mL]

表3 3 组受检者外周血细胞因子结果比较[（），pg/mL]

注：*代表与正常对照组对比，P＜0.05；#代表与糖尿病无胫前黑斑组对比，P＜0.05

指标 糖尿病伴胫前黑斑组（n=83）糖尿病无胫前黑斑组（n=84）正常对照组（n=80）IL-17 IL-22 TGF-β IL-10（45.23±12.68）*31.96±15.15（56.62±18.43）*#（40.75±13.46）*#（40.82±10.71）*29.64±17.15（69.13±17.79）*（53.95±10.58）*27.64±14.13 23.35±12.56 107.12±26.34 84.00±19.12

3 讨论

糖尿病患者胫前皮肤色素沉着又称胫前黑斑，早期研究发现为局部微循环障碍所致。 但如今对于经前黑斑形成及临床意义有很多不同的见解。可能皮肤色素沉着形成的影响因素很多：促进黑色素形成激素如前列腺素、性腺激素、肾上腺素分泌增多或抑制黑色素形成激素如甲状腺激素，褪黑素分泌减少以及体内酪氨酸酶氧化与抗氧化之间失衡均能促进黑色素的形成从而导致皮肤色素沉着[8-9]。 研究发现，炎症因素也是皮肤色素沉着的因素之一，当生物刺激或者物理、化学刺激局部皮肤的情况下，可使皮肤发生炎症反应。 进一步引起粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、前列腺素E2以及IL-8、IL-9 等炎症因子分泌增加，从而促进黑素的转运[10-11]。

免疫因素对于糖尿慢性并发症的研究逐渐增加，但胫前黑斑的相关研究国内外均涉及较少，邱明才等[12]研究发现，糖尿病胫前黑斑患者同时进行皮损局部活检及肾脏病理检查发现大量免疫复合物沉积， 如IgG、IgA、IgM、C1、C1q、FRA。 故免疫反应参与了糖尿病胫前黑斑以及肾脏病变的发生及发展，但具体机制仍有待深入研究。 Th17 细胞是近些年研究发现的CD4+T 淋巴细胞的新亚群，IL-6 和转化生长因子-β 联合作用可以诱导初始T 淋巴细胞分化成Th17 细胞，Th17 细胞可以分泌IL-17、IL-21 及IL-22 等炎症因子，参与炎症反应和自身免疫病的发生发展[13-14]，Treg 细胞可分泌IL-10 或通过细胞接触机制（CTLA-4 和GITR），调节和抑制免疫反应，其表达异常与糖尿病的发生密切相关[15-16]。 Th17与Treg 两者形成一个相互补充相互制约的平衡关系，在疾病状态，这种平衡则被打破[17]。 Th1、Th2、Th17、Treg细胞所致不同优势免疫应答与疾病的发生、发展及其预后有关。 Saltiykov BB 等[18]对糖尿病患者股部进行皮肤活检发现，患者皮肤的毛细血管壁有IgG、IgM 以及补体的附着。 因此，免疫复合物的堆积可能引起血管内皮损伤并诱导炎症从而引起微血栓形成,从而导致皮肤微循环障碍，但具体的机制仍需进一步研究证实。

该研究通过收集糖尿病并发胫前黑斑患者的临床资料，并取血液标本进行免疫细胞Th17 和Treg 细胞比例测定和相应的细胞因子测定，从而与糖尿病无并发胫前黑斑患者及正常对照组受检者进行对比，探讨糖尿病患者并胫前黑斑是否与其他慢性并发症相关，并且是否与免疫功能异常相关。

结果发现，与糖尿病无胫前黑斑患者对比，糖尿病并胫前黑斑患者血糖水平、血脂水平差异无统计学意义（P＞0.05），但 BMI 明显下降，提示体质量可能是局部皮肤的保护因素，是否与局部皮下脂肪量有关仍需要进一步探究。与糖尿病无胫前黑斑患者对比，糖尿病并胫前黑斑患者视网膜病变和尿微量白蛋白的发生率升高，提示糖尿病并胫前黑斑患者微血管并发症发生率升高，因此，出现胫前黑斑的糖尿病患者应注意排查糖尿病眼底病变、肾脏病变等微血管并发症。 局部皮肤的缺血缺氧容易导致色素沉着，由此推测皮肤的微血管病变可能与胫前黑斑发生相关。 并且结果也显示，糖尿病并胫前黑斑患者糖尿病足的发生率也明显升高，可能也与局部皮肤病变相关。

为进一步探索糖尿病局部皮肤病变的发病机制，该研究从免疫功能入手，探究胫前黑斑发病是否与免疫功能失衡有关，结果显示，与正常对照组对比，糖尿病患者Th17 细胞比例、IL-17 水平上升，Treg 细胞比例、TGF-β 水平、IL-10 水平下降，与糖尿病无胫前黑斑患者对比，糖尿病并胫前黑斑患者Treg 细胞比例、TGF-β 水平、IL-10 水平进一步下降。 提示糖尿病患者发病可能与免疫细胞Th17/Treg 比例失衡有关。 Th17 是促炎细胞，而Treg 是调节免疫炎症的细胞，与糖尿病无胫前黑斑患者对比，糖尿病并胫前黑斑患者Treg 细胞进一步下降，因此考虑胫前黑斑患者可能与TGF-β 水平、IL-10水平下降从而导致局部免疫功能紊乱致免疫炎症发生有关。

综上所述，合并胫前黑斑糖尿病患者易发生眼底病变、肾脏病变，并与糖尿足发病率升高相关，这可能与胫前黑变患者免疫细胞Th17/Treg 比例失衡导致TGF-β 水平、IL-10 水平下降有关。 该研究有很多不足之处，入组病例尚不完整，仍需要进一步收集病例资料。 由于涉及伦理问题，没有收集局部胫前黑斑的组织，无法进行局部指标的检测，进一步对机制进行研究和探讨。 对于细胞因子的表达是否与胫前黑斑的发生呈因果关系仍需要进一步的分子机制研究才能明确。