基于Klotho/FGF23通路探讨天麻钩藤饮对大鼠静脉桥血管氧化应激及内膜增生的影响*

王建民，孟 蓓，王胜利，辛利军

（河北以岭医院血管外科，石家庄 050000）

冠心病是常见的心血管疾病，近年来，其发病率不断升高且呈年轻化趋势[1]。冠状动脉旁路移植术（coronary artery bypass grafting，CABG）是该病治疗的主要方法，能有效改善患者预后[2]。大隐静脉（great saphenous vein，GSV）是CABG的常用移植血管，具有来源丰富、易获取、无排斥反应等优点[3]。然而，GSV与动脉吻合后因血管内皮细胞氧化应激损伤引起血管内膜增生，进而引起静脉桥血管再狭窄，导致远期闭塞率较高，严重影响CABG 远期疗效[4]。因此，如何减少静脉桥血管内膜增生是目前使用CABG 治疗亟需解决的问题。Klotho/成纤维细胞生长因子23（fibroblast growth factor 23，FGF23）是参与高血压发生发展及动脉硬化进展的常见通路，且Klotho、FGF23分别为慢性肾脏病患者颈动脉内膜、中膜厚度增厚的保护和危险因子[5-6]。天麻钩藤饮是治疗原发性高血压疾病的经典中草药方剂，研究表明，其作用机制与抑制氧化应激、维护血管内皮系统功能有关[7-8]。但天麻钩藤饮对静脉桥血管内膜增生的影响鲜有研究。本研究通过建立大鼠自体静脉移植模型，基于Klotho/FGF23通路探讨天麻钩藤饮对大鼠静脉桥血管氧化应激及内膜增生的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF 级雄性SD 大鼠，体重200～250 g，购于上海茂生衍生物科技有限公司，动物生产许可证号：SCXK（沪）2017-0004，于SPF级动物房中饲养，湿度50%～60%，温度20～25 ℃，光照12 h明/12 h 暗，自由摄食、饮水。本研究经河北以岭医院动物伦理委员会审核批准（审批号：201610201）

1.2 药品 天麻钩藤饮配制[9]：天麻9 g，钩藤（后下）12 g，生石决明（先煎）18 g，山栀9 g，黄芩9 g，川牛膝12 g，杜仲9 g，益母草9 g，桑寄生9 g，夜交藤9 g，朱茯神9 g。以上药物经河北以岭医院中药房鉴定均为正品，加水煎煮浓缩为1 g/mL 药液，4 ℃保存备用。

1.3 主要试剂与仪器 Klotho 阴性对照（NC）、Klotho 小干扰RNA（siRNA）序列及Klotho、FGF23、GAPDH 引物由北京赛百盛基因技术有限公司合成；实时荧光定量PCR（qRT-PCR）试剂盒购自美国Promega 公司；苏木精—伊红（HE）染色试剂盒购自南京建成生物技术有限公司；谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）检测试剂盒、丙二醛（MDA）酶联免疫吸附试验（ELISA）检测试剂盒均购自上海一研生物科技有限公司；RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天生物科技公司；Klotho 抗体、FGF23 抗体、增殖细胞核抗原（PCNA）抗体、GAPDH 抗体、羊抗兔lgG 购自Abcam 公司。显微镜（型号：ⅣC TK-870E）购自日本Olympus 公司；荧光定量PCR 仪（ABI 7500）为美国Applied Biosystems 公司产品；酶标仪（型号：SynergyH 1）购自美国BioTek公司；凝胶成像系统（型号：AlphaImager Mini）购自美国Protein Simple公司。

1.4 大鼠自体静脉移植模型建立[10]大鼠术前禁食8 h，腹腔注射10%水合氯醛（300 mg/kg）进行麻醉。尾静脉注射200 U/kg肝素钠，在颈部正中切开皮肤约2 cm，找到并分离右侧颈外静脉，结扎其属支，切取0.8～1.0 cm 远心端主干，用肝素钠盐水冲洗并浸泡在罂粟碱溶液中备用。于右侧气管旁、胸锁乳突肌下游离右颈总动脉至交叉处，期间用罂粟碱稀释液喷洒动脉血管表面。动脉两端用无损伤血管夹阻断两侧血流，切除中间动脉约0.5 cm，用肝素钠盐水冲洗血管腔。利用“cuff”套管技术吻合颈外静脉与颈总动脉，开放血管夹，观察到有力的血流搏动感即为自体静脉移植模型建立成功。洗涤手术区域，依次缝合肌肉、皮下组织及皮肤，术毕当天肌注40万U/kg青霉素抗感染。

1.5 动物分组及给药 将造模成功的48 只SD 大鼠随机分为模型对照组、天麻钩藤饮组、通路对照组和通路干预组，每组12只。参照成人天麻钩藤饮用量计算大鼠等效剂量（114 g/60 kg）×6.3≈12 g/kg[9]。天麻钩藤饮组、通路对照组和通路干预组大鼠每日给予天麻钩藤饮12 mL/kg灌胃，通路对照组和通路干预组大鼠每日给予Klotho NC（0.38 OD/mL）、Klotho siRNA（0.4 OD/mL）100 μL 尾静脉注射，模型对照组灌胃等量蒸馏水，1 次/d，连续给药28 d。

1.6 标本采集与处理 每组分别于术后2 周、4 周各随机取6只大鼠的移植静脉桥血管，冲洗干净，一部分血管组织固定于4%多聚甲醛，另一部分置于液氮中保存。

1.7 HE染色观察各组大鼠静脉桥血管病理形态及内膜增生情况 取4%多聚甲醛固定24 h 后的静脉桥血管组织，常规脱水、透明、浸蜡、包埋，制成5 μm厚切片，行HE 染色。显微镜下观察大鼠静脉桥血管病理形态。使用Image-ProPlus 6.0软件测量中段横截面的新生内膜厚度，取平均值。

1.8 qRT-PCR法检测大鼠静脉桥血管组织Klotho、FGF23 mRNA表达水平 取静脉桥血管，冰上制备匀浆，TRIzol 法提取总RNA，逆转录为cDNA，在荧光定量PCR仪上进行PCR扩增，采用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。PCR 反应条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，60 ℃延伸40 s，共40 个循环。引物序列如下：Klotho 上游：5’-TGATGTAGGCTGGCTGGCAGAG-3’，下游：5’-TGGTGGTGTAATGGCTCAACGC-3’；FGF23上游：5’-ATCAGAGGATGCTGGCTCCGTAG-3’，下游：5’-TAGCCGTTCTCTAGCGTCCACTG-3’；GAPDH 上游：5’-CGTTGACATCCGTAAAGACCTC-3’，下游：5’-TAGGAGCCAGGGCAGTAATCT-3’。

1.9 ELISA 法检测大鼠静脉桥血管中GSH-Px 活性、MDA含量 取静脉桥血管匀浆，离心，取上清，按照ELISA试剂盒说明书进行操作，测定样本与标准品在酶标仪450 nm波长处的吸光度，绘制标准曲线，计算静脉桥血管中GSH-Px活性和MDA含量。

1.10 Western blotting 法检测大鼠静脉桥血管中Klotho、FGF23、PCNA 蛋白表达 提取静脉桥血管组织蛋白，BCA法测定蛋白浓度。取适量蛋白进行10%SDS-聚丙酰胺凝胶电泳，湿转法转至聚偏氟乙烯膜上，分离目标条带，用5%脱脂奶粉封闭60 min，加入一抗（Klotho、FGF23、PCNA、GAPDH，均1∶600稀释）4 ℃孵育过夜，TBST洗涤，加入二抗（1∶2 000稀释）室温孵育1 h，TBST 洗涤；ECL 发光，成像仪中显影、拍照，Image J软件进行条带灰度值分析，以目的蛋白条带灰度值与内参蛋白条带灰度值的比值为目的蛋白表达量。

1.11 统计学方法 采用SPSS 19.0 软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠自体静脉移植模型构建情况 手术过程中无大鼠死亡，48 只大鼠均顺利完成手术，血管吻合口通畅，无出血、狭窄、血管扭曲等情况，术后能观察到移植静脉桥血管中血液充盈良好，血流搏动有力，剪断远心端能看到鲜红色血液流出，表明血流通畅，大鼠自体静脉移植模型构建成功。

2.2 4 组大鼠静脉桥血管病理形态 HE 染色结果显示，模型对照组术后2 周静脉桥血管内膜细胞明显增多，即出现增生，术后4周增生更加明显；术后2周，天麻钩藤饮组静脉桥血管内膜细胞层数明显减少，术后4周内膜增生改善更加明显，与通路对照组内膜厚度无明显差异；通路干预组较通路对照组内膜明显增厚，出现再狭窄现象，见图1。

图1 4组大鼠静脉桥血管病理形态（HE染色×200）

2.3 4组大鼠静脉桥血管内膜厚度比较 与模型对照组比较，天麻钩藤饮组大鼠术后2 周、4 周静脉桥血管内膜厚度均显著减小（均P＜0.05）；术后2周、4周，天麻钩藤饮组与通路对照组静脉桥血管内膜厚度比较，差异无统计学意义（均P＞0.05）；与通路对照组比较，通路干预组大鼠术后2 周、4 周静脉桥血管内膜厚度显著增加（均P＜0.05），见表1。

表1 4组大鼠静脉桥血管内膜厚度比较 ，n=6

表1 4组大鼠静脉桥血管内膜厚度比较 ，n=6

与模型对照组比较，aP＜0.05；与天麻钩藤饮组比较，bP＜0.05；与通路对照组比较，cP＜0.05。

2.4 4 组大鼠静脉桥血管中Klotho、FGF23 mRNA表达水平比较 与模型对照组比较，天麻钩藤饮组大鼠术后2 周、4 周静脉桥血管中Klotho mRNA 水平显著升高，FGF23 mRNA 水平显著降低（均P＜0.05）；天麻钩藤饮组与通路对照组比较，术后2周、4周静脉桥血管中Klotho、FGF23 mRNA水平比较，差异无统计学意义（均P＞0.05）；与通路对照组比较，通路干预组大鼠术后2 周、4 周静脉桥血管中Klotho mRNA水平显著降低，FGF23 mRNA水平显著升高（均P＜0.05），见表2。

表2 4组大鼠静脉桥血管中Klotho、FGF23 mRNA表达水平比较 ，n=6

表2 4组大鼠静脉桥血管中Klotho、FGF23 mRNA表达水平比较 ，n=6

与模型对照组比较，aP＜0.05；与天麻钩藤饮组比较，bP＜0.05；与通路对照组比较，cP＜0.05。

2.5 4 组大鼠静脉桥血管中GSH-Px 活性、MDA 含量比较 与模型对照组比较，天麻钩藤饮组大鼠术后2 周、4 周静脉桥血管中GSH-Px 活性显著升高，MDA含量显著降低（均P＜0.05）；术后2周、4周，天麻钩藤饮组与通路对照组静脉桥血管中GSH-Px活性、MDA 含量比较，差异无统计学意义（均P＞0.05）；与通路对照组比较，通路干预组大鼠术后2周、4周静脉桥血管中GSH-Px活性显著降低，MDA含量显著升高（均P＜0.05），见表3。

表3 4组大鼠静脉桥血管中GSH-Px活性、MDA含量比较 ，n=6

表3 4组大鼠静脉桥血管中GSH-Px活性、MDA含量比较 ，n=6

与模型对照组比较，aP＜0.05；与天麻钩藤饮组比较，bP＜0.05；与通路对照组比较，cP＜0.05。

2.6 4 组大鼠静脉桥血管中Klotho、FGF23、PCNA蛋白表达比较 与模型对照组比较，天麻钩藤饮组大鼠术后2周、4周静脉桥血管中Klotho蛋白水平显著升高，FGF23、PCNA 蛋白水平显著降低（均P＜0.05）；术后2 周、4 周，天麻钩藤饮组与通路对照组静脉桥血管中Klotho、FGF23、PCNA 蛋白水平比较，差异无统计学意义（均P＞0.05）；与通路对照组比较，通路干预组大鼠术后2 周、4 周静脉桥血管中Klotho 蛋白水平显著降低，FGF23、PCNA 蛋白水平显著升高（均P＜0.05），见图2、表4。

表4 4组大鼠静脉桥血管中Klotho、FGF23、PCNA蛋白表达水平比较 ，n=6

表4 4组大鼠静脉桥血管中Klotho、FGF23、PCNA蛋白表达水平比较 ，n=6

与模型对照组比较，aP＜0.05；与天麻钩藤饮组比较，bP＜0.05；与通路对照组比较，cP＜0.05。

图2 4组大鼠静脉桥血管中Klotho、FGF23、PCNA蛋白表达

3 讨论

尽管药物治疗、介入治疗等治疗可在一定程度上缓解冠心病病情发展，CABG 仍是治疗冠心病的主要且有效手段，然而，术后静脉桥血管发生再狭窄会影响桥血管的近期、远期通畅率[11]。基础研究显示，静脉移植过程中，血流切应力改变、手术操作机械性损伤、组织缺血再灌注等因素均会引起血管内皮细胞损伤，进而刺激血小板源性生长因子、成纤维细胞生长因子、活性氧等各种细胞因子及炎症介质释放，导致平滑肌细胞异常迁移、增殖，同时平滑肌细胞不断分泌细胞外基质，使得血管内膜不断增厚以适应动脉血流，最终导致移植静脉再狭窄发生[12-13]。本研究采用静脉移植手术，术中保证血管吻合口通畅，无出血等异常情况，术后可见移植静脉桥血管中血液充盈，血流搏动有力，血流通畅，表明大鼠自体静脉移植模型建立成功。

天麻钩藤饮收载于《杂病证治新义》，是治疗高血压病的经典方剂，由天麻、钩藤、生石决明、山栀、黄芩、川牛膝、杜仲、益母草、桑寄生、夜交藤、朱茯神组成，天麻、钩藤平肝熄风，生石决明平肝潜阳，山栀、黄芩清肝降火，川牛膝活血利水，杜仲、桑寄生补肝益肾，夜交藤、朱茯神宁心安神，合用具有平肝熄风、清热活血、补益肝肾的功效[14-15]。冯惠枝[16]研究发现，天麻钩藤饮能抑制患者细胞内Ca2+及炎症因子释放，有效改善高血压患者血管内皮功能损伤及血管重塑。本研究建立大鼠自体静脉移植模型后给予大鼠天麻钩藤饮灌胃，发现术后2 周、4 周时大鼠静脉桥血管内膜厚度均显著减小，提示天麻钩藤饮可以抑制静脉桥血管内膜增生。GSH-Px、MDA 分别为重要的抗氧化酶和脂质过氧化反应最终产物，是检测抗氧化应激水平及氧化应激水平的重要参考指标[17]。本研究结果显示，与模型对照组比较，天麻钩藤饮组大鼠术后2 周、4 周静脉桥血管中GSH-Px 活性显著升高，MDA 含量显著降低，提示天麻钩藤饮可抑制氧化应激，提高机体抗氧化能力，减轻血管内皮功能损伤，进而抑制静脉桥血管内膜增生。

Klotho/FGF23 通路是影响冠心病、慢性肾脏疾病、高血压等疾病血管功能的重要通路[18-19]。有研究发现，Klotho蛋白水平升高能减少活性氧的产生，抑制肾脏细胞氧化应激反应[20]。陈金艳等[6]研究表明，Klotho 蛋白对血管内皮细胞具有保护作用，而FGF-23水平升高与内皮功能紊乱相关，两者均能影响颈动脉内膜中膜厚度变化。本研究结果显示，使用天麻钩藤饮后，大鼠术后2 周、4 周静脉桥血管中Klotho mRNA 及蛋白水平显著升高，FGF23 mRNA及蛋白水平显著降低，提示天麻钩藤饮可能通过上调Klotho 表达并下调FGF23 表达保护血管内皮细胞。此外，本研究在使用天麻钩藤饮治疗的同时向大鼠尾静脉注射Klotho siRNA抑制Klotho表达，发现静脉桥血管中Klotho mRNA 及蛋白表达量显著降低，FGF-23 mRNA 及蛋白表达量显著升高，同时GSH-Px 活性显著降低，MDA 含量显著升高，血管内膜厚度显著增加，静脉桥血管出现再狭窄现象，进一步提示天麻钩藤饮改善静脉桥血管内膜增生的机制可能与上调Klotho 表达及下调FGF23 表达有关。

综上所述，天麻钩藤饮可能通过激活Klotho/FGF23 信号通路抑制自体静脉移植大鼠静脉桥血管中氧化应激反应，改善血管内膜增生。