急性心肌梗死与2型糖尿病相关差异基因的GEO芯片分析*

杜 宽，孙 悦，梁瑜祯，李争明，夏 宁

（1.广西医科大学第一附属医院，南宁 530021；2.广西医科大学第二附属医院，南宁 530007；3.广西医科大学附属武鸣医院，南宁 530199）

心血管疾病是我国居民死亡的头号原因[1]。以往的研究表明，糖尿病、高胆固醇、高血压、年龄等多种危险因素都可能导致急性心肌梗死（AMI）的发生，特别在合并糖尿病后，临床症状更复杂，治疗难度更高，其死亡率进一步加重[2-3]。糖尿病是一种常见的代谢性疾病，其特征为胰岛素分泌相对或绝对不足引起的慢性高血糖。与未合并2 型糖尿病（T2DM）患者相比，AMI合并T2DM患者发病较早，心功能较差，冠脉病变支数较多，范围较广，易并发心力衰竭、心律失常及感染等，预后较差[2]。二者相互影响，在发病机制上有一定的相似性，关系密切[4]，均为影响人类生命健康的一大威胁，进行早期诊断与筛查对提高患者预后至关重要。故本研究分别对AMI和T2DM的差异基因（DEG）进行筛选，得到两者共同的DEG，通过基因本体论（GO）和《京都议定书》的基因和基因组百科全书（KEGG）富集分析、蛋白质相互作用（PPI）网络分析、受试者工作特征曲线（ROC曲线）分析，旨在筛选出连接AMI和T2DM 的具有一定诊断意义的关键基因，为合并两种疾病的患者早期预测及诊断提供参考，但是具体的发病机制需要进一步实验验证。

1 材料与方法

1.1 数据来源 从GEO 数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/，查询日期：2019-10-10）下载AMI和T2DM 的基因表达谱数据集，其中包括6 个基因表达数据集。GSE66360 数据集总结了49 例AMI患者和50例非AMI对照的基因表达谱。GSE60993数据集包含7例AMI患者和7例非AMI对照的基因表达谱。GSE20966数据集由来自10例T2DM患者和10例非糖尿病对照的基因表达谱组成。GSE25724数据集包含6 例T2DM 患者和10 例非糖尿病对照的基因表达谱。GSE38642 数据集由9 例T2DM 患者和10 例非糖尿病对照组成。GSE7014 数据集总结了20 例T2DM 患者和6 例非糖尿病对照的基因表达谱。由于GEO的数据库是公开可用的，因此该数据未提及道德认可。

1.2 在AMI 和T2DM 中筛选DEG 使用limma R软件包获得两种疾病的DEG，包括数据集成、归一化和汇总。通过确定|log2fold-change|≥1，可以将调整后的P＜0.05 视 为AMI 和T2DM 数据中的DEG。收集从AMI和T2DM中筛选出的DEG，使用在线分析工具Venn（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/，查询日期：2019-10-10）实现两种疾病的共同基因。

1.3 常用基因功能和途径富集分析 基于6 个数据集中的常用基因，使用Clusterprofiler R软件包进行GO术语和KEGG途径分析。在GO富集分析中，包括3 个部分，即基因本体生物学过程（BP）、细胞成分（CC）和分子功能（MF）。

1.4 PPI网络构建和中心基因的鉴定 获取的常见基因，利用相互作用基因的检索工具（STRING）11.0（http://string-db.org/）构建PPI 网络。要求的最低互动得分设定为高置信度（0.700）。结果通过Cytoscape 3.6.1（https://cytoscape.org）可视化。为了验证中枢基因，使用名为cytoHubba（http：//hub.iis。sinica）的插件。已安装Cytoscape 软件中的edu.tw/cytohubba/）并运行以进行分析。

1.5 统计学方法 采用SPSS 22.0 软件绘制ROC曲线，计算曲线下的面积（AUC）。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 DEG 和选定共同基因的鉴定 将GSE66360和GSE60993 的两个AMI 数据集整合后，与正常对照组相比，在AMI 患者中鉴定出200 个DEG；将GSE20966 数据集、GSE25724 数据集、GSE38642 数据集和GSE7014数据集合并在一起并删除重复项，T2DM患者与非T2DM者相比有4676个DEG，见图1。在AMI和T2DM中共有84个共同基因，见图2。

图1 火山图

图2 糖尿病与急性心肌梗死共同差异基因的韦恩图

2.2 共同差异基因的功能和途径富集分析 GO结果表明，BP的变化主要涉及炎症反应、免疫反应、中性粒细胞趋化性等。在MF 部分，主要涉及受体活性和结合相关功能，如脂多糖受体活性、RAGE受体结合等。CC的变化包含与细胞膜有关的基因的大量富集，如膜组成部分、质膜的组成部分、细胞外囊泡、细胞外区域等。这些基因的KEGG通路主要在人类传染病（结核病、利什曼病、疟疾和百日咳）、破骨细胞分化、造血系统相关通路（C型凝集素受体和造血细胞谱系）和炎症相关的信号传导途径（IL-17、吞噬体和Toll样受体途径），见图3。

图3 KEGG途径富集分析

2.3 PPI 网络分析及中心基因鉴定 通过STRING的在线工具和可视化软件Cytoscape，绘制常见基因的PPI网络（图4）。同时，Cytoscape的cytoHubba插件也用于计算相互作用程度最高的前10 个中枢基因，即白介素1β（IL1B）、Toll 样受体（TLR）2、Fc 受体共同γ链（FCER1G）、白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B 成员2（LILRB2）、TLR4、甲酰基肽受体1（FPR1）、CD33、类骨脂素1（ORM1）、前列腺素－过氧化物过氧化物合酶2（PTGS2）和Fcγ受体II a（FCGR2A），见图5。这些中枢基因可能成为AMI 和T2DM 的潜在靶标。经查询文献筛选后，选择与两种疾病相关讨论较多的前6位的中枢基因进行进一步分析。

图4 PPI网络

图5 HUB基因的一致性百分比

2.4 排名前6 的HUB 基因在AMI 和T2DM 中的诊断价值 AUC 大小能反映潜在生物标志物的诊断能力。在AMI患者和正常对照中，IL1B、TLR2、FCER1G、LILRB2、TLR4 和FPR1 的AUC 分别为0.835（95%CI：0.763～0.906，P＜0.001）、0.839（95%CI：0.764～0.914，P＜0.001）、0.803（95%CI：0.723～0.883，P＜0.001）、0.835（95%CI：0.763～0.906，P＜0.001）、0.869（95%CI：0.804～0.933，P＜0.001）和0.823（95%CI：0.746～0.900，P＜0.001），见图6。

图6 HUB基因在AMI中的ROC曲线

在T2DM 患者和正常对照中，IL1B、TLR2、FCER1G、LILRB2、TLR4 和FPR1 的AUC 分别为0.770（95%CI：0.682～0.858，P＜0.001）、0.801（95%CI：0.718～0.883，P＜0.001），0.820（95%CI：0.743～0.900，P＜0.001）、0.792（95%CI：0.703～0.880，P＜0.001）、0.798（95%CI：0.715～0.882，P＜0.001）、0.780（95%CI：0.685～0.874，P＜0.001），见图7。

图7 HUB基因在T2DM中的ROC曲线

3 讨论

AMI 和T2DM 是全世界相当普遍的疾病。血糖、血压、血脂异常及高凝状态均可使2型糖尿病患者急性心肌梗死的发生率升高，故尽早在上述方面做好预防和控制，对延缓和减少糖尿病患者心血管事件的发生是至关重要的。本研究中共从GEO 检索了6 个数据集，与正常对照相比，获得了AMI 和T2DM 中的84 个共同基因。通过富集分析来确定一些GO术语和KEGG途径，在PPI网络构建中选择与AMI和T2DM有紧密关系的10个基因，并评估了排名前6 位的中枢基因的诊断效率（P＜0.001），结果显示，上述6个基因的AUC值均大于0.7，提示其诊断能力具有较高的可靠性。这些基因可能在未来AMI 和T2DM 的预防和治疗中发挥重要的生物学功能。

IL1B属于IL基因家族，是免疫炎症机制中著名的调节剂之一[5]。先前的研究表明，在AMI 的早期阶段，一些心肌细胞处于缺血状态，IL1B 被缺血性内皮细胞释放，在随后的时间里，它会逐渐被白细胞潜入心肌[6]。最近的研究表明，通过注射针对IL1B 的疫苗，可以有效地恢复胰岛B 细胞的数量，促进细胞增殖，抑制细胞凋亡，并且可以明显改善葡萄糖耐量和胰岛素敏感性[7]。在这项研究中，通过KEGG通路分析，包括了大部分与免疫相关的信号通路，如与IL1B 密切相关的IL-17 信号通路。TLR是一种蛋白质分子，在非特异性免疫过程中起着关键作用[8]。Arslan 等[9]报道显示，与野生型小鼠相比，TLR2 基因敲除（TLR2/-）小鼠的心肌梗死面积小，心脏功能改善，恶性心律失常的死亡率和发生率降低。TLRs不仅在心肌细胞中表达，也在胰岛β 细胞中表达。体内胰岛素抵抗可能与TLR4 信号通路的上调有关[10]。

FCER1G是编码由带有Fc R的细胞表达的IgEFc受体的γ的亚基之一[11]。有学者对健康人血小板中的全血血栓形成进行研究，发现FCER1G 可能被上调并影响血栓形成过程[12]。在T2DM 中，关于FCER1G的研究也很少。但是从免疫学和新陈代谢的角度来看，Igs 可以刺激脂肪生成，这被证实对人具有抗炎作用，揭示脂肪细胞上存在Fc 受体和Fc刺激的胰岛素以及脂肪生成，这些因素也可能促进了T2DM 的发 展[13]。LILRB2 属于LILRB 亚家族，LILRBs在骨髓细胞和造血干细胞中广泛表达，对许多免疫细胞具有抑制作用[14]。本研究KEGG 分析中，发现AMI 和T2DM 参与造血系统相关的途径，这可能表明LILRB2 基因在其中起着重要作用。LILRB2 和T2DM 之间的关系几乎没有研究，大多数LILRB2研究集中在肿瘤和血液系统疾病。但是笔者推测，由于T2DM 与心血管疾病和微血管疾病的伴发程度较高，LILRB2 可能在这些机制中起作用，需要进一步研究以探究内部原因。FPR1是G蛋白偶联模式识别受体家族的成员之一，主要由哺乳动物的吞噬细胞表达，并且参与炎症和组织损伤[15]。研究表明，缺血再灌注损伤大鼠FPR1表达水平升高，而沉默FPR1表达后，大鼠心肌梗死面积减小[16]。

本研究通过生物信息学方法阐明了AMI 与T2DM 之间的潜在联系，为深入研究二者疾病发生发展及诊断预测提供了较可靠的靶标。然而，我们需要进一步通过体内、外实验验证这些靶基因，了解其各自特定的功能。