蜂胶中白杨素衍生物抗高尿酸活性研究

徐军，杨美林，仲崇琳

（吉林省中医药科学院中医药基础所，吉林长春130012）

高尿酸血症是指血液中的尿酸浓度超出正常范围的一种代谢性疾病[1]。研究表明，近年来我国高尿酸血症及痛风的发病率呈逐渐上升趋势，且其与一些代谢性疾病如糖尿病、肥胖症及心脑血管疾病等密切相关[2,3]。尿酸（uric acid,UA）是人类嘌呤及核酸分解代谢的最终产物，由于人体内没有尿酸酶，所以尿酸可以作为代谢的终产物直接排出体外。食物中的嘌呤经过嘌呤分解、嘌呤物质之间的转化和反馈性调节嘌呤合成等生物反应过程中生成UA，多种代谢酶如5’-核苷酸酶（5’nucleotidase,5’-NT）、腺苷脱氨酶（adenosine de-aminase,ADA）、黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase,XO）和嘌呤核苷磷酸化酶（pufine nucleoside phosphorylase,PNP）参与该代谢过程。腺嘌呤核糖核苷酸在5’-NT作用下脱磷酸生成腺苷；ADA在嘌呤分解代谢途径中，主要催化腺嘌呤核苷（A）和脱氧腺嘌呤核苷（dA）不可逆的脱氨，分别生成次黄嘌呤核苷及脱氧次黄嘌呤核苷；PNP和XO是嘌呤分解途径后期的关键酶，次黄嘌呤核苷在PNP作用下，分解成次黄嘌呤，次黄嘌呤在XO的作用下生成黄嘌呤及UA。因此，嘌呤分解代谢途径是尿酸生成的直接途径，该途径的关键酶均可能成为抗高尿酸血症药物的潜在靶点[4]。XO抑制剂如Allopurinol、Febuxostat现已广泛应用于临床；试验证明PNP抑制剂（Ulodesine）能有效降低体内UA水平，同时降低血液中黄嘌呤和次黄嘌呤的含量，是安全性和耐受性较好的降尿酸药物，目前已进入Ⅱ期临床[5]。CHY10化学名是8-[(2,4-二氟苯氨基)甲基]-5,7-二羟基-2-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮，系本课题组以蜂胶提取物白杨素为原料合成的Mannich碱衍生物。前期研究发现，白杨素Mannich碱衍生物在体内体外对XO有抑制作用[6]。灌胃给予白杨素Mannich碱衍生物可以明显降低高尿酸血症小鼠的血清尿酸水平，并发现其降尿酸的机制与抑制XO活性相关，已获专利授权（专利号：ZL201610256522.7）[7]。然而，CHY10对嘌呤分解途径上的其他关键酶类如5’-NT、ADA和PNP等的影响未见报道。本研究旨在通过UA前体物质次黄嘌呤和尿酸酶抑制剂氧嗪酸钾联合造模法制备高尿酸血症小鼠，并在其体内考察CHY10对血清尿酸（serum uric acid,SUA）及XO活性影响情况，以及是否对肝脏中5’-NT、ADA和PNP的mRNA表达有调节作用，进一步阐明其治疗高尿酸血症的作用机制。

图1 8-[（2,4-二氟苯氨基）甲基]-5,7-二羟基-2-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮（CHY10）的结构式Fig.1 The structure of 8-[(2,4-difluoroanilino)methyl]-5,7-dihydroxy-2-phenyl-4H-1-benzo-4-ketone

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料白杨素衍生物CHY10是由本实验合成，方法参见文献[6]；别嘌醇片：广东彼迪药业有限公司产品。临用前用0.5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）配制成不同浓度，备用。

1.1.2 实验动物SPF级雄性昆明种小鼠，体重为18～22 g（购自辽宁长生生物技术有限公司），实验动物生产许可证号：SCXK（辽）2015-0001，动物质量合格证号：211002300016301，实验动物使用许可证号：SYXK（吉）2010-0006。饲养环境为屏蔽环境，自由摄食、饮水。

1.1.3 试剂尿酸试剂盒、黄嘌呤氧化酶试剂盒，均由南京建成生物工程研究所提供；液相用试剂均为色谱纯，购自成都艾科化学试剂经销有限公司。

1.2 仪器

PECTRA MAX190全波长酶标仪（美国Molecular Devices公司）；SONICS V超声细胞破碎仪（美国Sonic公司）；ND-1000核酸蛋白定量检测仪（NanoDrop公司）；CFX-96 PCR仪（美国BIO-RAD公司）；水平电泳仪（美国BIO-RAD公司）；Gel Doc XR凝胶成像分析仪（美国BIO-RAD公司）。

1.3 方法

1.3.1 动物分组、给药和造模 昆明小鼠，随机分为6组（n=10）：正常对照组，高尿酸血症模型组，CHY10高、中、低剂量组（10 mg/kg、5 mg/kg和2.5 mg/kg），阳性药别嘌醇组（1 mg/kg）。采用次黄嘌呤和氧嗪酸钾联合造模法，每天上午10时给予次黄嘌呤300 mg/kg+氧嗪酸钾250 mg/kg，造模药物用3 g/L的CMC-Na溶液配制成相应的混悬液，除正常对照组给予等量蒸馏水灌胃外，其余各组采用对应造模药物灌胃。灌胃体积均为0.1 mL/10g，连续给药7 d，每天1次。从给予造模剂开始，CHY10高、中、低剂量组每天下午13时分别灌胃给药相应浓度的CHY10，连续7 d，每天1次；阳性药组给予1 mg/kg别嘌醇，连续7 d，每天1次。模型组和正常对照组给予等体积的0.5% CMC-Na[8]。实验期间所有小鼠均正常饮食。末次给药1 h后从小鼠眼眶后静脉丛取血1.5 mL，放置30 min后，7 000 r/min离心10min，取100μL采用试剂盒法测定SUA水平[9]，并进行血清中XO的活性检测。试验数据均以±s表示，采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，采用成组t检验对两组均数比较。

1.3.2 RT-PCR实验小鼠眼眶后静脉丛取血后，取肝组织，液氮速冻1h后，-80℃冰箱贮存待测酶mRNA的表达。查询NCBI并参考文献，利用Pubmed中Pick Primer在线软件挑选引物[10,11]，对产物进行Blast以确保扩增基因特异性（表1），引物由上海生工生物有限公司合成。取50～100 mg肝脏到研磨管中，加入适量TRIzol，按试剂盒说明书提取总RNA并进行定量，逆转录合成cDNA第一条链，进行PCR扩增。5’-NT的PCR条件为94℃5min，94℃1min，55.7℃1min，72℃1 min；ADA的PCR条件为94℃3 min，94℃30 s，55℃30 s，72℃30 s；PNP的PCR条件为94℃3 min，94℃30 s，52℃30 s，72℃30 s；均是35个循环[10]。

表1 PCR引物序列Table 1 The primer sequence used in real time PCR analysis

1.3.3 PCR产物半定量分析利用Gel Doc XR凝胶成像系统进行凝胶成像，在1.5%琼脂糖凝胶电泳上对各组PCR的产物进行分析，分别计算每条泳道上的特异PCR产物，其与GAPDH总强度的比值即表示各组样品的特异酶基因mRNA的水平。

2 结果与分析

2.1 CHY10对高尿酸血症小鼠血清尿酸水平的影响

末次给药1h后采血测定各组小鼠SUA，结果见表2。与正常组相比，模型组小鼠的SUA显著升高，提示该模型成功；与模型组相比，阳性药别嘌醇组SUA显著降低，差异有统计学意义（P＜0.001）；CHY10高剂量10 mg/kg可显著降低SUA（P＜0.001），中剂量5 mg/kg降低SUA（P＜0.01），低剂量2.5 mg/kg对SUA无影响。

表2 CHY10对高尿酸血症小鼠血尿酸的影响（±s，n=10）Table 2 Effects of CHY10 on serum uric acid levels in hyperuricemic mice(±s，n=10)

表2 CHY10对高尿酸血症小鼠血尿酸的影响（±s，n=10）Table 2 Effects of CHY10 on serum uric acid levels in hyperuricemic mice(±s，n=10)

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；与正常组比较###P＜0.001。Note:compared with the model group,*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001;compared with the control group,###P＜0.001.

组别Group 剂量（mg/kg）Dose 血清尿酸（μmol/L）SUA正常组 - 89.92±10.58模型组 - 131.77±11.18###阳性药组 1 90.66±9.37***CHY10-H 10 98.53±7.64***CHY10-M 5 115.34±12.55**CHY10-L 2.5 126.71±11.23

采用试剂盒测定血清中XO的活性，结果见表3。模型组的XO活性升高，提示该模型成功（P＜0.05）；给药后，CHY10高剂量组的血清XO活性有所降低（P＜0.05）。

表3 CHY10对高尿酸血症小鼠XO的影响（±s，n=10）Table 3 Effects of CHY10 on XO activities in serum of hyperuricemic mice

表3 CHY10对高尿酸血症小鼠XO的影响（±s，n=10）Table 3 Effects of CHY10 on XO activities in serum of hyperuricemic mice

注：与模型组比较，*P＜0.05,**P＜0.01，***P＜0.01；与正常组比较#P＜0.05。Note:comparedwithmodelgroup,*P＜0.05,**P＜0.01;comparedwithcontrolgroup,#P＜0.05.

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2.2 CHY10对高尿酸血症小鼠XO上游相关酶5’-NT、ADA、PNP mRNA的影响

模型组的5’-NT mRNA表达产物与正常组相比有所上调，但差异无统计学意义（P＞0.05）。与模型组相比，CHY10各剂量组和阳性药组对高尿酸血症小鼠肝组织中的5’-NT mRNA表达没有明显影响，见图2。

图2 CHY10对高尿酸血症小鼠5’-NT mRNA的相对表达量的影响Fig.2 Effects of CHY10 on expression of 5’-NT mRNA in hyperuricemic mice

模型组的ADA mRNA表达产物与正常组相比有所上调，但差异无统计学意义；与模型组相比，CHY10各剂量组可以上调高尿酸血症小鼠肝组织中ADA mRNA的表达，且随着剂量的增加表达水平升高，但差异无统计学意义，别嘌醇组ADA mRNA的表达与模型组相比没有下调，见图3。

图3 CHY10对高尿酸血症小鼠ADA mRNA的相对表达量的影响Fig.3 Effects of CHY10 on expression of ADA mRNA in hyperuricemic mice

模型组的PNP mRNA表达产物与正常组相比有所下调，但差异无统计学意义；与模型组相比，CHY10各剂量组可以下调高尿酸血症小鼠肝组织中PNP mRNA的表达，以CHY10中剂量组降低最显著，但是差异无统计学意义，见图4。

图4 CHY10对高尿酸血症小鼠PNP mRNA的相对表达量的影响Fig.4 Effects of CHY10 on expression of PNP mRNA in hyperuricemic mice

3 结论

本研究采用次黄嘌呤和氧嗪酸钾联合造模法，该模型相对稳定，对肝肾损伤相对较小，能够通过检测血清尿酸和肌酐水平进而判断成功与否以及小鼠肾脏功能的健康程度，是目前广泛采用的高尿酸血症模型建立方法之一。结果表明，末次给药后，CHY10低、中、高剂量组和别嘌醇组均能降低尿酸水平。体内活性测定表明，CHY10能明显抑制XO的活性，对PNP、ADA和5'-NT的mRNA表达无明显影响。