外源药剂预处理对蒙古黄芪种子活力及活性氧、线粒体膜电位的影响

2021-12-08鲁海坤于营隋昕刘亚苓于芸泽郭靖

特产研究 2021年6期

鲁海坤，于营，隋昕，刘亚苓，于芸泽，郭靖

（中国农业科学院特产研究所，吉林长春130112）

种子老化是指种子活力自然衰退的过程，这是一种不可逆转的过程，成为农业生产及种质资源保存的不利因素[1]，因此，研究种子老化机理，探求适宜种子的保存条件，对于农业生产、优质种质资源保存和生物多样性保护等具有重要意义[2]。目前普遍认为活性氧造成的氧化胁迫是种子老化的主要原因[3]。1980年，Miquel等[4]提出了衰老的线粒体学说，认为活性氧、线粒体和种子老化三者密切相关。线粒体可以为细胞的生命活动提供能量，是进行氧化磷酸化形成ATP的主要场所，被誉为细胞的“能量工厂”。此外，线粒体还参与细胞信号传递、细胞分化和细胞凋亡等，在调控细胞和机体生命活动方面发挥重要作用[5-7]；同时，线粒体也是活性氧产生的主要部位[8]，植物细胞消耗的氧中约有1%在线粒体中产生活性氧，其中由线粒体呼吸链底物端漏出的电子还原O2单电子生成的O2-是线粒体活性氧的主要来源[9]。O2-是多数活性氧的前体，可以被超氧化物歧化酶转变为过氧化氢。在正常生理状态下，植物细胞内活性氧的产生和消除处于动态平衡状态，但当植物遭受胁迫时，细胞内的活性氧积累过多引起氧胁迫，线粒体最先受到伤害。Wang等[10]在榆树种子老化研究初步揭示了种子老化过程中线粒体作用的机理，即活性氧可使线粒体膜通透性转换孔（MPTP）开放，进而导致线粒体膜电位降低，随后释放细胞色素c和细胞死亡诱导因子，最终诱导细胞死亡。

N-乙酰基-L-半胱氨酸（NAC）是一种广谱活性氧抑制剂，可以有效清除细胞中的过氧化氢，超氧阴离子和羟自由基等活性氧有抑制细胞凋亡的作用，在生物医药研究中应用广泛[11-13]。环孢霉素A（CsA）可以与MPTP组件上的亲环素蛋白结合，从而抑制MPTP开放，维持线粒体膜电位，抑制细胞色素c释放，减少细胞凋亡的发生[14,15]。

蒙古黄芪（Astragalus mongholicus Bunge）是豆科黄芪属多年生药用植物，其干燥根名为黄芪，是我国传统的大宗药材。由于近年来野生黄芪资源过度采挖，商品黄芪主要来源于人工栽培，种子是蒙古黄芪的主要繁殖材料，因此，为保证蒙古黄芪产业的发展和优质种质资源的保存，研究其种子老化机理和适宜的贮藏方法尤为重要。本试验通过NAC和CsA预处理蒙古黄芪种子，研究外源药剂处理对种子活力、活性氧含量以及线粒体膜电位的影响，分析蒙古黄芪种子老化与活性氧和线粒体的关系，以期为探索种子老化机理和种子保存提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

试验种子购于河北省安国市，经中国农业科学院特产所郭靖研究员鉴定为蒙古黄芪种子，种子初始发芽率为89%，发芽指数为30.3，含水量为9.8%。

1.2 方法

1.2.1 种子预处理随机挑选种子，用不同浓度的NAC（0、5、10、20、40 mmol/L）、CsA（0、30、60、90、120mol/L）浸泡4 h（浓度0为蒸馏水），之后用蒸馏水冲洗3遍，再于室温下回干2 d，当种子含水量降至初始含水量后，用铝箔袋密封包装，保存于4℃冰箱备用。

1.2.2 种子老化处理将预处理后的蒙古黄芪种子置于恒温水浴锅（53±0.5℃）中进行老化3 d处理。

1.2.3 种子发芽测定种子发芽率测定参照ISTA（1996）方法进行[16]，挑选大小一致的蒙古黄芪种子，置于培养皿内的滤纸上，每皿100粒，3次重复，于光照培养箱内发芽，温度和光照控制为15/25℃（高温8 h/低温16 h，高温时光照，低温时黑暗，光照强度为36 mol m-2s-1）逐日检查发芽种子数，第7天统计发芽率和发芽指数。

1.2.4 活性氧和线粒体膜电位测定参照Ratajczak[17]的方法，使用DCFH-DA（2,7-Dichlorodi-hydrofluorescein diacetate）探针检测活性氧含量。取吸胀后的蒙古黄芪种子，用镊子去掉种皮，切下胚轴，并用双刀片进行徒手切片，将切片浸入5M DCFH-DA（用0.01 M PBS稀释，pH7.4），于室温黑暗下染色30 min，然后用PBS冲洗3次，每次5 min。用生物荧光显微镜（Olympus BX53）观察并拍照，激发光和发射光波长分别为464～495 nm（蓝色）和515～555 nm（绿色）。

参照Kobayashi[18]的方法，使用JC-1荧光染料检测线粒体膜电位变化。取蒙古黄芪种子胚轴的手工切片，浸入10g/mL JC-1（用0.01M PBS稀释，pH7.4），于黑暗下染色20 min，然后用PBS冲洗3次，每次5 min。用生物荧光显微镜（Olympus BX53）观察并拍照，激发光和发射光波长分别为528～554 nm（绿色）和575～633 nm（红色）。以图片灰度值表示荧光强度。

2 结果与分析

2.1 不同浓度NAC预处理对人工老化种子发芽指标的影响

如图1所示，不同浓度NAC处理的蒙古黄芪种子经人工老化3 d后，其发芽率和发芽指数存在显著差异（P＜0.05）。蒸馏水对照试验的种子发芽率和发芽指数分别为60%和18.0，相比空白种子（未经人工老化和外援药剂预处理）分别下降32.7%和40.6%；40 mmol/L NAC处理的种子发芽率和发芽指数最低，分别为13%和3.7；20 mmol/L NAC处理的种子发芽率和发芽指标稍高于40 mmol/L NAC，分别为41%和11.9；5 mmol/L NAC处理的种子与0 mmol/L NAC处理之间发芽率和发芽指数均无显著差异（P＞0.05），且高于20 mmol/L和40 mmol/L NAC处理，而10 mmol/L NAC处理的种子发芽率和发芽指数显著高于其他处理（P＜0.05），发芽率为78.7%，发芽指数为24.9，相比0mmol/LNAC（蒸馏水）处理，其发芽率提高31.2%，发芽指数提高38.3%。以上研究结果表明，低浓度NAC处理有益于种子活力的保持，可提高种子老化后的发芽率和发芽指数，而高浓度NAC可能对种子有毒害作用导致种子活力降低，且10mmol/LNAC预处理能有效提高种子抗老化能力，发芽指标显著高于蒸馏水处理。

图1 不同浓度NAC处理对种子老化后发芽指标的影响Fig.1 The effect of different concentrations of NAC treatments on the germination indicator of seeds after aging

2.2 不同浓度CsA处理对人工老化蒙古黄芪种子发芽指标的影响

如图2所示，不同浓度CsA预处理对老化后蒙古黄芪种子活力影响不同。随着CsA浓度升高，种子老化后其发芽率和发芽指标整体呈先降低后上升，之后基本保持恒定。与蒸馏水空白处理相比，30mol/L CsA预处理再老化3 d后，种子发芽率和发芽指数下降，分别为55.3%和15.5；60mol/L CsA处理的种子发芽率和发芽指标未发生显著变化（P＞0.05）；90mol/L CsA处理的种子发芽率和发芽指数分别提高16.2%和21.1；120mol/L处理的种子发芽率和发芽指数分别提高14.5%和16.1，但与90mol/L CsA处理组无显著差异（P＞0.05）。说明适宜浓度的CsA可以有效提高种子活力，且在一定浓度之上再提高其浓度，种子发芽指标不再提高。

图2 不同浓度CsA预处理对种子老化后发芽指标的影响Fig.2 The effect of different concentrations of CsA treatments on the germination indicator of seeds after aging

2.3 外源药剂处理对人工老化蒙古黄芪种子活性氧含量的影响

应用DCFH-DA探针标记蒙古黄芪种子胚轴中的活性氧，分析不同浓度NAC预处理对种子老化后其胚轴内活性氧含量变化的影响。如图3所示，不加活性氧探针的阴性对照整个视野都没有荧光信号，表明没有自发荧光干扰（图3 a）；未进行老化处理的种子胚轴，可见有微弱的绿色荧光，表明胚轴内有少量的活性氧（图3 b）；蒸馏水预处理后老化3 d的种子胚轴，可见较亮的绿色荧光（图3 c），说明种子在老化3 d后其胚轴内活性氧明显增加；10 mmol/L NAC预处理后再老化3 d的种子胚轴（图3 d），其绿色荧光较蒸馏水预处理后老化3 d处理的种子胚轴弱，说明10mmol/L NAC预处理能大幅减少种子胚轴内的活性氧积累；90mol/LCsA预处理后再老化3d的种子胚轴（图3e），其绿色荧光强度明显低于图3 c，略高于图3 d，说明90mol/L CsA预处理有助于减轻老化过程中种子胚轴的活性氧积累。

图3 外源药剂处理对种子活性氧含量的影响Fig.3 The effect of exogenous medicament treatments on the active oxygen content of seed hypocotyls

2.4 外源药剂处理对人工老化蒙古黄芪种子线粒体膜电位的影响

线粒体是机体供能的主要细胞器，而线粒体膜电位是维持线粒体内氧化磷酸化、产生ATP的先决条件。用特异性荧光染料JC-1对不同处理的种子胚轴线粒体膜电位进行检测。如图4所示，不加JC-1染料的阴性对照（图4 a）未检测到荧光信号，表明种子胚轴没有自发荧光干扰；未进行老化处理的种子胚轴（图4 b），其红色荧光强，表明其线粒体膜电位（△m）高；蒸馏水预处理后老化3 d的种子胚轴（图4 c），其红色荧光弱，膜电位低；经10 mmol/L NAC预处理后再老化3 d的种子胚轴（图4 d），其红色荧光较强，膜电位较高；经90mol/LCsA预处理后再老化3d的种子胚轴（图4e），其红色荧光较弱，膜电位较低。以上结果表明NAC和CsA预处理能有效提高老化种子的线粒体膜电位。

图4 外源药剂处理对蒙古黄芪种子线粒体膜电位的影响Fig.4 The effect of exogenous medicament treatments on the mitochondrial membrane potential of Astragalus mongolica seeds

3 讨论

3.1 活性氧引起种子活力降低

种子衰老是一个复杂的量变到质变的连续过程，表现出形态、物理化学反应和生理生化代谢等一系列变化[19]。种子衰老的原因和机理有多种解释，包括膜系统损伤、有毒物质积累、酶活性降低、内源激素不平衡和核酸蛋白质等大分子物质降解等多个方面。在种子衰老的众多理论中，被广泛接受的是衰老的自由基学说[20]，认为种子在其生长发育过程中不断进行的有氧代谢产生了活性氧自由基，在种子采收贮藏期间随时间延长不断积累，过量的活性氧攻击生物膜，诱导发生脂质过氧化作用，并且抑制了种子内抗氧化系统的形成，造成种子内活性氧产生和清除失衡，膜脂过氧化程度加剧，表现为丙二醛含量大幅增加，致使体内维持细胞正常生理活性的酶失活及DNA降解等，诱导细胞死亡，种子活力降低[21-23]。

本试验中，蒙古黄芪种子经人工老化后，其活性氧含量上升，线粒体膜电位降低，导致细胞功能异常，种子活力降低。而经10 mmol/L NAC预处理的种子，其胚轴活性氧含量降低，线粒体膜电位升高，种子发芽率和发芽指数都有显著提升，可能是由于NAC提高了细胞内非酶抗氧化物质还原型谷胱甘肽（GSH）的含量，清除了多余的活性氧（ROS），增强了细胞抗氧化能力，从而减轻了细胞的氧化损伤[24]，增强了种子的抗老化能力，延缓了种子衰老。

3.2 线粒体参与种子老化过程

衰老的自由基学说不断发展完善，形成现在的脂质过氧化学说和衰老的线粒体学说。衰老的线粒体学说认为，线粒体的呼吸电子传递链是种子内源性ROS产生的主要部位，在种子的衰老过程中，线粒体中活性氧积累导致其最先发生氧化损伤，进而引起细胞功能异常，加速种子衰老死亡[25]。在种子老化过程中，ROS攻击线粒体膜中不饱和脂肪酸，脂质过氧化作用破坏了线粒体膜的完整性，线粒体发生膨胀，增加的电子漏反过来进一步促进ROS的产生和积累，形成恶性循环[26]。

线粒体膜电位是维持线粒体进行氧化磷酸化产生ATP的先决条件，同时也能反应出线粒体内膜通透性和细胞活性[27]。活性氧和膜损伤可以相互作用，Wang等[28]在烟草研究中发现，ROS可以使线粒体通透性转变孔（MPTP）持续性开放，分子质量大的物质可非选择性进入孔道，此时线粒体发生肿胀、外膜破裂，线粒体膜电位下降。膜电位的持续降低甚至完全崩解会导致ATP产生不足，凋亡诱导因子释放，活性氧进一步积累，启动PCD加速种子的老化[29,30]。

Wang等[10]在榆树种子老化研究中，发现活性氧与线粒体通透性转换孔组分的表达呈正相关，导致细胞氧化还原电位失衡，线粒体外膜破裂，跨膜电位（△m）丧失，ATP产生水平下降，最终细胞发生程序性死亡。而线粒体膜通透性转换孔的不正常开放可以被抗坏血酸（AsA）和CsA有效缓解，通过AsA和CsA预处理可以减缓膜电位的损失，降低人工老化对种子活力的影响。

本试验中，蒙古黄芪种子经人工老化后，其活性氧含量升高，线粒体膜电位下降，种子活力大幅下降，而经90mol/L CsA预处理的种子，其活性氧含量减少，线粒体膜电位有所提高，种子的发芽率和发芽指标显著高于蒸馏水处理的种子，可能是因为CsA抑制了MPTP开放，减少了细胞色素c和其他凋亡因子的释放，减轻了种子老化过程中线粒体结构与功能的损伤，保证了ATP的供应，在一定程度上抑制了细胞凋亡，使种子活力下降速度减缓。