基于网络药理学分析葛根山楂人参颗粒解酒保肝的作用机制

李阳，赵天倚，步洪石，王淑敏

（长春中医药大学，吉林长春130117）

近年来，酒精性肝病的发病率呈逐年上升变化趋势，临床治疗主要通过阻断酒精摄入和药物辅助两方面对其进行干预，常因患者配合度低戒酒效果不佳从而达不到治疗效果，而长时间服药会产生副作用从而对机体产生毒害反应。药食两用中草药安全性高，患者以食疗代替药疗的模式可达到对慢性疾病预防的目的[1]。

葛根山楂人参颗粒由葛根6 g、砂仁6 g、山楂3 g、麸炒白术3 g、人参和茯苓各1.5 g配制而成，具有解酒保肝、化酒祛湿、温中和胃的功效。有关研究人员发现，解酒护肝产品能够显著提高受试动物体内乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的活力，同时可降低血清中谷草转氨酶和谷丙转氨酶的平均含量以及丙二醛含量，增加机体内肝脏超氧化物歧化酶活力及还原性谷胱甘肽含量，起到解除酒毒保护肝脏功能的效果[2-4]。本研究拟采用网络药理学的方法，从靶点预测、网络分析及分子对接以及动物实验揭示葛根山楂人参颗粒解酒保肝作用的药理机制。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂

雄性昆明小鼠，体重20～22 g，SPF级，由辽宁长生生物技术有限公司提供，生产许可证编号：SCXK（辽）2020-0001；合格证编号：210726200100461748。正常饲养，自由摄取水和食物，保持12 h光暗循环。

葛根山楂人参颗粒由长春中医药大学实验室制备。甘草酸二铵肠溶胶囊（中国正大天晴药业集团有限公司，批号：200711102）；二锅头白酒（北京顺鑫农业股份有限公司，批号：20200618）；丙二醛（MDA，批号：20210322）、还原性谷胱甘肽（GSH，批号：20210320）、甘油三脂（TG，批号：20210322），以上试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.2 分组、造模及给药

将所有实验动物随机分为4组，每组10只，即空白组、模型组、甘草酸二铵组（60 mg kg-1）[5]和葛根山楂人参颗粒组（800 mg kg-1），各组按照相应剂量连续灌胃10 d。最后一天，给药4 h后，除空白组外，其余各组均以每剂量12 h的间隔灌胃2剂56°白酒（12 mL kg-1），空白组给予等量的蒸馏水[6]。

1.3 组织指标检测

试验小鼠末次给予酒精1 h后，颈脱臼处死，取部分肝组织制成10%肝组织匀浆，4℃离心，取上清液。根据试剂盒说明书测定肝组织上清液中MDA、GSH和TG的水平[7,8]。

1.4 葛根山楂人参颗粒中化学成分检索与筛选

运用中草药系统药理学平台（TCMSP，http://tcmspw.com）[9]，分别输入关键词“葛根”、“砂仁”、“人参”、“白术”和“茯苓”，检索5味中药中含有的化学成分，整合得到相应的化学成分，将化合物口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18作为筛选要求[10-18]。再结合中医药百科全书数据库ETCM（http://www.tcmip.cn/ETCM/index.php/Home/Index/)检索山楂的活性成分[12]。

1.5 靶点的预测与“处方中药-成分-靶点”网络构建

在PubChem数据库中下载活性成分的化学结构，将其导入靶点预测数据库Swiss Target Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）进行靶标预测，得到的靶标通过UniProt（https://www.uniprot.org/）数据库，校准其标准基因名，种群限定为“Homo sapiens”，获取作用于人种的葛根山楂人参颗粒的有效靶点[10,12,18,19]。整理中药、成分、靶点表格文件，将其导入Cytoscape3.7.2软件构建“葛根山楂人参颗粒中药-成分-靶点”网络。

1.6 疾病靶点的筛选与构建

以酒精性肝病为关键词，限定物种为“Homo sapiens”，通过GeneCards、OMIM、Drugbank和PharmGkb等数据库获取作用于疾病的相关靶点。

1.7 葛根山楂人参颗粒蛋白互作（PPI）网络的构建与分析

将与酒精性肝病相关靶点和葛根山楂人参颗粒的成分靶点进行交互，结果导入STRING（https://stringdb.org/）数据库，构建蛋白间的相互作用关系，保存TSV格式的互作结果文件，并导入Cytoscape3.7.2软件进行Network Analyzer分析[10]，将重复和孤立边删除，以节点（node）由大到小、颜色由深到浅用于反映网络连接度[20,21]，保存设置，输出文件得到葛根山楂人参颗粒作用靶点PPI网络图。

1.8 靶点的基因本体及通路富集分析

为了进一步明确筛选出的靶标蛋白基因的功能以及在信号通路中的作用，将1.2所得处方相关成分靶点导入matescape数据库(http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)[22]，本数据库整合了GO、KEGG、UniProt和DrugBank等数据库内容，其数据更新较快，能够完成通路富集分析和生物过程注释，操作时将靶基因名称列表保存文本文档进行上传，物种限定为人，转换gene ID后，进行GO生物学过程注释、聚类分析和KEGG通路富集分析，将所得KEGG分析结果前20个条目的P值进行转换，运用微生信绘图云平台（http://www.bioinformatics.com.cn/login/）对所得结果进行气泡图绘制。

1.9 分子对接

运用AutoDock软件将PPI蛋白互作网络中度值前3的NFKB1、NR3C1和SRC分别与筛选出来的3个关键成分进行分子对接；在PubChem数据库中查询相应化合物结构，结果文件保存为SDF格式，通过导入Open Bable软件，将其转化保存为mol2格式，打开分子对接软件AutoDock Tools 1.5.6将其加氢，并计算电荷等操作后保存为pdbqt格式文件。在蛋白质数据库PDB（https://www.rcsb.org/）中下载3个蛋白的三维晶体结构pdb格式文件，导入Pymol软件将蛋白的水分子以及小分子配体去除后，导入Auto-Dock Tools进行加氢，计算电荷操作，完成后保存文件为pdbqt格式。打开AutoDock Vina 4.0软件，进行分子对接[11,12]，将得到的最优对接结果导入Discovery Studio 2020 Client进行视图优化处理。

2 结果

2.1 葛根山楂人参颗粒对酒精性肝损伤小鼠MDA、GSH和TG的影响

与空白组相比，模型组肝组织中的MDA水平、TG含量显著升高（P＜0.01），GSH水平显著降低（P＜0.01）。与模型组相比，葛根山楂人参颗粒给药组MDA水平显著降低（P＜0.05），TG含量显著降低（P＜0.05），GSH水平显著升高（P＜0.05）[23]。以上结果表明葛根山楂人参颗粒可以明显减轻酒精性肝损伤小鼠氧化应激指标变化，同时升高还原型谷胱甘肽含量，起到对肝脏的保护作用，结果见表1。

表1 小鼠肝组织中MDA、TG和GSH含量Table 1 Contents of MDA,TG and GSH in the mice liver tissue

2.2 处方中药活性成分及靶标筛选结果

TCMSP数据库对葛根山楂人参颗粒进行检索共得到89个活性成分，其中葛根4个，山楂31个，人参22个，麸炒白术7个，砂仁10个，茯苓15个，剔除重复项最终获得活性成分59个，与活性成分相关的靶点共1 474个，去除重复项获得靶点956个。运用Cy-toscape软件绘制所得葛根山楂人参颗粒中药-成分-靶点网络如图1，绿色圆形为处方中5味中药，橙色三角形为活性成分，紫色菱形为对应靶点[20]。拓扑网络分析得到度值前3位的成分为Dehydroeburiconic acid（去氢没食子酸）、Sulfurenic acid（硫色多孔菌酸）和Quercetin（槲皮素）对应度值分别为47、38和21。

图1 葛根山楂人参颗粒中药-成分-靶点网络Fig.1 The drug-component-target network of Gegen Hawthorn Ginseng granules

2.3 PPI网络构建结果

运用STRING数据库平台分析葛根山楂人参颗粒中的组方靶点，将靶点与靶点之间相互作用关系导出作用结果另存文件为TSV格式，将文件导入Cytoscape软件进行分析，经互作网络的拓扑学计算，结果显示其涉及80个节点，154条边，如图2所示；其中以圆形节点代表蛋白，以每条边表示蛋白与蛋白之间的相互作用关系，两个蛋白之间有边相连即代表其存在相互作用。其中以节点颜色深浅、形状大小表示度值的高低，颜色越深、形状越大代表该节点度值越高，即该节点的关键程度越高[20,21]。以度值大小梯度排序得到交互作用较多的靶标前10个为NR3C1、NFKB1、SRC、RXRA、AKTI、NCOA2、PPARG、ESR1、AR和AER1C3。AKTI、NCOA2与肿瘤的生物学特征均有一定关系，相关蛋白与AKTI结合可抑制前列腺癌细胞转移[24]；NCOA2的融合可作为类似卵巢性索肿瘤的子宫肿瘤诊断评估[25]。ESR1、NR3C1、AR系列为激素受体基因，涉及雌激素、糖皮质激素和内分泌调节等信号通路。有研究表明，ESR1表达CCL23的表达受ESR1转录调控；另一方面，CCL23可以抑制AKT信号的激活，从而促进ESR1的表达，在肝癌细胞中形成反馈环，从而抑制肝癌的发展[26]。AKT是细胞存活的信号和必要因素，它参与细胞的生长和增殖，发挥了重要作用[27]；同时AKT1在肝细胞和肝星状细胞的纤维生成过程中起到了抑制作用[28]，对于防治肝纤维化的发展提供了新的思路。

图2 葛根山楂人参颗粒解酒保肝作用潜在靶点蛋白-蛋白互作（PPI）网络分析Fig.2 The PPI network analysis of Gegen Hawthorn Ginseng Granule in relieving alcoholism and protecting liver

2.4 GO富集分析及KEGG富集分析

取葛根山楂人参颗粒解酒护肝作用相关的前80个主要靶点进行GO富集分析和KEGG通路富集分析，在GO分析得到的生物过程结果中选取前20个富集程度最高的生物过程[6]，输出条目图表见图3。其主要包括类固醇代谢、细胞对有机环状化合物反应、一元羧酸代谢过程、脂质代谢过程的调节和对有毒物质的反应。基因功能聚类结果展示了各生物过程间的关系联接包括细胞对有毒物质、脂代谢、脂多糖、细胞分化和氧化应激的反应等，见图4和图5。图4是由群集着色构成的网络，节点颜色接近的是具有其中相同群集ID的生物过程，图5是由P值着色构成的网络，其中具有较深着色的代表其含有较多基因的项并具有较显著的P值；KEGG分析选取前20条富集程度最高的信号通路见图6，相关靶点主要在癌症、类固醇激素生物合成、EB病毒感染、甲状腺激素信号、胰高血糖素信号和胆汁分泌异常等通路上富集。

图3 GO富集分析前20条条目Fig.3 The first 20 entries of GO enrichment analysis

图4 葛根山楂人参颗粒解酒保肝作用GO聚类分析（群集着色）Fig.4 Gegen Hawthorn Ginseng Granule in relieving alcoholism and protecting liver GO clustering analysis(cluster coloring)

图5 葛根山楂人参颗粒解酒护肝作用GO聚类分析（值显著性着色）Fig.5 Gegen Hawthorn Ginseng Granule in relieving alcoholism and protecting liver GO clustering analysis(value significant coloring)

图6 葛根山楂人参颗粒解酒保肝作用前20条KEGG通路富集分析Fig.6 The first 20 entries of KEGG channel enrichment analysis for Gegen Hawthorn Ginseng Granule in relieving alcoholism and protecting liver

2.5 分子对接结果

当分子与受体稳定结合时，结合能越低，发生相互作用的可能性则越大，结果显示，Dehydroeburiconic acid与SRC最小结合能为-8.63 kJ/mol，Sulfurenic acid与SRC最小结合能为-7.67 kJ/mol，Sulfurenic acid与NR3C1最小结合能为-4.91 kJ/mol，皆具有稳定的结合表现[11,12]。核心化合物Dehydroeburiconic acid、Sulfurenicacid与SRC及NR3C1对接模式如下图。

图7 Dehydroeburiconic acid与SRC对接模式图Fig.7 The dehydroeburiconic acid and SRC docking mode diagram

图8 Dehydroeburiconic acid与SRC成键方式图Fig.8 The dehydroeburiconic acid and SRC bonding mode diagram

图9 Sulfurenic acid与SRC对接模式图Fig.9 The sulfurenic acid and SRC docking mode diagram

图10 Sulfurenic acid与SRC成键方式图Fig.10 The sulfurenic acid and SRC bonding mode diagram

图11 Sulfurenic acid与NR3C1对接模式图Fig.11 The sulfurenic acid and NR3C1 docking mode diagram

图12 Sulfurenic acid与NR3C1成键方式图Fig.12 The sulfurenic acid and NR3C1 bonding mode diagram

表2 靶点PDB ID信息Table 2 The PDB ID information of target

3 讨论

酒精性肝病已经严重影响人类的身体健康，多是由于长期大量饮酒而导致慢性中毒性肝损伤，发病初期主要症状为轻度脂肪肝，进而可发展成酒精性肝炎、肝纤维化和肝硬化，严重时可导致肝功能衰竭[29,30]。现代临床治疗多给予保肝、抗炎药物多烯磷脂酰胆碱、还原型谷胱甘肽和水飞蓟素类等，改善肝脏生物化学指标，达到保肝作用。对于轻中度酒精性脂肪肝的药物如甘草酸二铵、甘草酸单铵半胱氨酸等应用也十分广泛[31,32]。美他多辛可加速酒精从血清中清除，可改善慢性酒精中毒后的肝功能[33]。随着多种抗炎保肝药物的长期服用，其带来的毒副作用也越发明显，进一步增加了患者肝脏负担。中药复方具有多成分、多靶点和多途径的作用优势，其安全性较高，能够发挥良好的药效。

本研究通过TCMSP、TCMID、ETCM数据库检索和筛选后共获得了59个潜在活性成分，将筛选得到重要性前3的活性成分与蛋白互作网络中度值前3位的核心靶蛋白进行了分子对接验证，其中槲皮素和脱氢没食子酸等化合物相关的靶蛋白较多且稳定性较好，与核心靶点能够较好地结合；槲皮素属于黄酮类化合物，研究表明该类化合物具有改善脂肪酸代谢、抗炎、抗氧化、调节肠道微生物群和胆汁酸、保护肝脏的作用[34]。没食子酸属于多酚化合物，研究表明多酚类化合物可通过抗氧化、抗炎、脂质调节、抑制细胞凋亡、调节肠道微生物群组成和抗纤维化的作用机制达到对肝脏的保护作用[35]。PPI网络得到的核心靶点NFB1基因，其多态性可影响NF-B信号通路的活化水平[36]，当人体内摄入过多酒精后，过量酒精产生的毒性作用导致活性氧自由基大量生成，从而引起肝细胞膜脂质的过氧化，同时内毒素水平的剧增诱导了NF-B的激活，大量的炎症介质由此产生，并与炎症级联放大作用效应，导致重要的细胞器受到侵害，从而引发肝细胞功能紊乱甚至造成肝细胞凋亡或坏死，最终影响肝脏功能并导致酒精性肝病的形成[37,38]。分子对接过程中葛根山楂人参颗粒中的活性成分与NFB1基因可以稳定结合，从而抑制炎症的发展达到保护肝脏的目的。SRC激酶是在多种肿瘤的发生、发展、迁移和侵袭起着重要作用的一个抗肿瘤药物靶点，在肺癌、乳腺癌、肾癌、直肠癌和胰腺癌等多种肿瘤中都有较高水平的表达。SRC激酶抑制剂药物对肝纤维化有良好的治疗效果[39,40]，同时抑制肝癌的发展。对接结果显示，蛋白NR3C1与葛根山楂人参颗粒中的主要成分结合良好，而NR3C1是一种糖皮质激素受体，研究表明NR3C1与NCOA1、NCOA2、NOCRO1和FKBP5等蛋白存在相互作用，并且参与了炎症反应、细胞增殖和分化等生物过程[41]。在炎症反应中，抗炎细胞因子可在糖皮质激素的诱导下合成[42]，炎性细胞因子白介素6（IL-6）、白介素8（IL-8）和肿瘤坏死因子-（TNF-）的合成受到抑制，药物即可发挥抗炎和免疫抑制作用，干预炎症反应，从而达到防治肝炎、阻断肝纤维化发展的效果。其中，作为一种急性和慢性炎症的主要调节因子白介素6，密切影响了肝细胞的坏死程度，肝衰竭的严重程度也可以通过IL-6的高表达去反应[43]。临床上，激素治疗酒精性肝病的案例，效果也较为显著[44]。但由于个体差异以及激素耐受人群的不同，在用于治疗酒精性肝病上还存有争议。葛根山楂人参颗粒是在经典解酒方剂葛花解酒汤的基础上重新配伍调制，通过相关数据库分析葛根山楂人参颗粒得到的活性成分与SRC、NR3C1等蛋白具有较好的对接活性，在分子层面上，药物靶点作用疾病靶标，二者稳定结合，阻断疾病的发生，达到防御的目的。通路分析结果显示，葛根山楂人参颗粒可参与甾类激素生物合成通路、癌症通路和胰高血糖素通路等发挥其药理作用。相关研究表明甾类化合物对于抗炎、抗癌和镇痛等方面能够发挥良好的药用效果[45]。处方中的成分基因促进甾类化合物的合成，形成抗炎屏障，抑制炎症的产生。本研究通过大数据的分析与处理，对于中药复方药理作用机制的探索提供了一定的参考价值，进一步体现了葛根山楂人参颗粒对于解酒护肝的临床治疗潜力。

综上所述，通过网络药理学和分子对接技术分析了葛根山楂人参颗粒治疗酒精性肝病的潜在作用机制，为酒精性肝病的防治提供了新的思路与依据，同时对于解酒护肝保健食品的研发也提供了新的方法。以食疗代替药疗，让中医养生走入寻常百姓家，致力更多研究开发保肝护肝的新产品，促进健康产业蓬勃发展！