芪蛭通脉颗粒对冠心病血脂异常大鼠PCSK9/LDLR通路的影响*

宋欠红 樊 睿 李 易 叶 勇 柳 尧 何昕徽 赵 淳△

（1.云南中医药大学第一临床医学院，云南 昆明 650500；2.云南省昆明市中医院，云南 昆明650500）

血脂异常主要包括血浆总胆固醇（TC）、三酰甘油（TAG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）代谢异常。TC、TAG、LDL-C升高和（或）HDL-C降低为常见类型。血脂异常是多种心脑血管疾病如动脉粥样硬化、脑血管意外、高血压、冠心病等的独立危险因素［1］。我国高脂血症的发病率呈逐年上升趋势，已成为危害健康的重要因素［2］。

芪蛭通脉颗粒是云南省荣誉名中医、云南中医药大学终身教授赵淳教授经验方。运用该方治疗血脂异常取得较好的临床疗效，前期临床研究发现该方对血脂异常患者TC、TG、LDL-C、HDL-C调控作用明显。本实验是通过观察芪蛭通脉颗粒对冠心病大鼠血脂异常的调节作用及前蛋白转化酶枯草溶菌素9（PC⁃SK9）/低密度脂蛋白受体（LDLR）信号通路相关蛋白及血管细胞间黏附分子1（VCAM-1）、细胞间黏附分子-1（ICAM-1）的调控，探讨其对血脂异常的作用机制［3-5］。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性健康SPF级Wistar大鼠60只，体质量220～260 g，由昆明医科大学动物中心生产，生产许可证号：SCXK（滇）2018-0003，大鼠合格证号：430067000017126。实验前1周在实验环境中饲养，自由进食、饮水。饲养温度（20±2）℃，湿度：30%～70%。

1.2 实验药物 自拟方芪蛭通脉颗粒（由炙黄芪20 g，水蛭粉3 g，三七6 g，红曲6 g，灯盏细辛15 g组成），由四川新绿色药业科技发展有限公司生产（批号：2008029）。阿托伐他汀钙片，辉瑞制药有限公司生产（规格：20 mg/片，批号：ED02825）。

1.3 试剂与仪器 BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术研究所；兔源PCSK9抗体购自美国Cell signaling technology公司；兔源LDLR抗体购自美国Cell signaling technology公司；兔抗鼠VCAM-1单克隆抗体购自美国abeam公司；兔抗鼠ICAM-1单克隆抗体购自美国santa-cmze公司。TAG、TC、HDL-C、LDL-C检测试剂盒购自星汉科技公司。电子分析天平由德国sartorius公司生产；凝胶成像设备由美国BIO-RAD公司生产。

1.4 造模与分组 大鼠适应性喂养1周后随机分为6组，每组10只，分别为：空白对照组、模型组、阿托伐他汀组以及芪蛭通脉颗粒高、中、低剂量组。在张文立等［6-7］报道方法的基础上进行改良，复制大鼠冠心病模型。除空白对照组外，其余各组均喂饲高脂饲料（10%猪油，2%胆固醇，0.5%胆酸钠，0.2%丙基硫氧嘧啶，87.3%基础饲料）8周，每日灌胃1次，按5 mL/kg液体量灌胃，空白对照组给予等量蒸馏水灌胃。第8周第4日开始，空白对照组继续给予等量蒸馏水灌胃。其余组给予垂体后叶素腹腔注射，按每次30 U/kg，每日1次，连续给药3 d。第3日注射后30 min内描记心电图，若满足ST段抬高超过0.1 mV，T波高耸，心律不齐，则视为造模成功。

1.5 干预方法 实验组于第9周开始灌药，连续治疗4周。实验动物与成人用药量的换算方法参考文献［8］，阿托伐他汀钙组给予阿托伐他汀钙水溶液灌胃（按10 mg/mL水溶液，13 mg/kg体质量给药）；芪蛭通脉低、中、高剂量组予以芪蛭通脉药液1、2、4倍给药（按1 g/mL水溶液，6.5 g/kg为低剂量，13 g/kg为中剂量，26 g/kg为高剂量给药）。空白对照组与模型组灌胃等剂量生理盐水。

1.6 观察指标 12周实验结束后，将动物分别称重，按体质量予以5 mL/kg腹腔内注入10%水合氯醛麻醉。待麻醉生效后，将大鼠仰卧位固定四肢，碘伏消毒皮肤，切开胸腹壁组织，暴露主动脉，在腹主动脉处5号采血针采血5 mL，室温2 000 r/min离心20 min后，取上清液即血清分装于ependor管置于-20℃冰箱。1）检测血清TAG、TC、HDL-C、LDL-C，严格按照试剂说明书进行检测。2）Western blotting法检测PCSK9、LDLR、VCAM-1和ICAM-1等蛋白水平。打开腹腔，清除淤血，取出肝脏组织，用眼科剪剪碎，放置于10 mL离心管中，加入裂解液，匀浆器匀浆，使其充分裂解，转移至1.5 mL EP管中，12 000 r/min离心15 min，温度4℃，取上清液，-80℃环境中保存；按BCA说明书蛋白定量测定，根据蛋白分子量配置合适浓度的分离胶与浓缩胶，连接好电泳设备，将电压调制80 V电泳，预染Marker分离出红色条带后，将电压调到120 V恒定。加入转膜液，转膜2 h，转膜结束后孵育一抗，洗膜，孵育二抗，显色，得出待测蛋白的条带，用凝胶成像分析系统扫描蛋白条带后进行光密度分析。

1.7 统计学处理 应用SPSS22.0统计软件。各组数据以（±s）表示，运用方差分析进行统计学处理。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠血清TAG、TC、HDL-C、LDL-C水平比较 见表1。与空白对照组比较，模型组大鼠血清TC、TAG、LDL-C水平均显著升高，HDL-C水平显著降低（P<0.01）；与模型组比较，阿托伐他汀组和芪蛭通脉低、中、高剂量组大鼠血清TC、TAG、LDL-C水平均降低（P<0.05）；阿托伐他汀组和芪蛭通脉低、中、高剂量组大鼠血清HDL-C水平均较模型组升高（P<0.05）；芪蛭通脉低、中、高剂量组大鼠血清HDL-C水平与阿托伐他汀组比较差异无统计学意义（P>0.05）；芪蛭通脉中、高剂量组大鼠血清TC、TAG、LDL-C水平与阿托伐他汀组比较差异无统计学意义（P>0.05）。

表1 各组大鼠血清TAG、TC、HDL-C、LDL-C水平比较（mmol/L，±s）

表1 各组大鼠血清TAG、TC、HDL-C、LDL-C水平比较（mmol/L，±s）

注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01；与阿托伐他汀组比较，△P<0.05。下同。

组别空白对照组模型组阿托伐他汀组芪蛭通脉低剂量组芪蛭通脉中剂量组芪蛭通脉高剂量组n 10 10 10 10 10 10 TAG 0.81±0.04**2.76±0.32 1.05±0.22 1.93±0.27*△1.31±0.30*1.23±0.29*TC 3.55±0.68**9.31±1.23 5.17±0.88 6.58±1.01*△6.33±1.05*5.89±0.97*HDL-C 1.92±0.23**0.65±0.05 1.28±0.15 1.22±0.21*1.31±0.24*1.35±0.16*LDL-C 1.87±0.21**5.81±0.73 3.03±0.36 3.63±0.44*△3.55±0.55*3.82±0.56*

2.2 各组大鼠肝脏PCSK9、LDLR表达水平 见图1，表2。结果显示，与空白对照组比较，模型组大鼠肝脏PCSK9水平上调（P<0.01），LDLR表达水平下调（P<0.01）；与模型组比较，阿托伐他汀组、芪蛭通脉中、高剂量组PCSK9水平下调（P<0.05）；与模型组比较，阿托伐他汀组、芪蛭通脉低、高剂量组LDLR水平上调（P<0.05）；芪蛭通脉中、高剂量组与阿托伐他汀组比较，在PCSK9方面差异无统计学意义（P>0.05）；芪蛭通脉低剂量组与阿托伐他汀组比较，在PCSK9方面有明显差异（P<0.05），芪蛭通脉低、高剂量组与阿托伐他汀组比较，在LDLR方面无统计学差异（P>0.05）；芪蛭通脉中剂量组与阿托伐他汀组比较，在LDLR方面有统计学差异（P<0.05）。

图1 各组大鼠肝脏PCSK9、LDLR表达水平

表2 各组大鼠肝脏PCSK9、LDLR相对表达水平比较（±s）

表2 各组大鼠肝脏PCSK9、LDLR相对表达水平比较（±s）

组别空白对照组模型组阿托伐他汀组芪蛭通脉低剂量组芪蛭通脉中剂量组芪蛭通脉高剂量组n 10 10 10 10 10 10 PCSK9 0.60±0.15**1.53±0.22 0.89±0.16*1.24±0.31△0.91±0.17*0.79±0.21*LDLR 0.69±0.15**0.41±0.05 0.68±0.09*0.58±0.10*0.52±0.09△0.62±0.12*

2.3 各组大鼠肝脏VCAM-1和ICAM-1表达水平 见图2，表3。结果显示，与空白对照组比较，模型组大鼠肝脏VCAM-1、ICAM-1水平上调（P<0.01）；与模型组比较，阿托伐他汀组、芪蛭通脉中、高剂量组VCAM-1和ICAM-1水平下调（P<0.05）；芪蛭通脉中、高剂量组与阿托伐他汀组比较，在VCAM-1、ICAM-1方面无统计学差异（P>0.05）；芪蛭通脉低剂量组与阿托伐他汀组比较，在VCAM-1、ICAM-1方面差异有统计学意义（P<0.05）。

图2 各组大鼠肝脏VCAM-1和ICAM-1表达水平

表3 各组大鼠肝脏VCAM-1和ICAM-1相对表达水平比较（±s）

表3 各组大鼠肝脏VCAM-1和ICAM-1相对表达水平比较（±s）

images/BZ_47_1248_1602_2252_1664.png空白对照组模型组阿托伐他汀组芪蛭通脉低剂量组芪蛭通脉中剂量组芪蛭通脉高剂量组10 10 10 10 10 10 0.43±0.08**0.91±0.26 0.66±0.11 0.91±0.18△0.78±0.14*0.74±0.21*1.02±0.17**1.66±0.36 1.13±0.22 1.31±0.26△1.19±0.24*1.11±0.16*

3 讨论

高脂血症是动脉粥样硬化的首要危险因素，临床常用的治疗药物有他汀类、贝特类、胆固醇吸收抑制剂、烟酸等。但长期用药特别是他汀类会引起谷丙转氨酶、谷草转氨酶升高，出现肌痛、肌炎、横纹肌溶解、头痛、失眠、抑郁及消化不良等不良反应［9］。

本文通信作者赵淳教授认为高脂血症的发生发展是由于饮食不节、过食肥甘和（或）由于正虚，脾肝肾三脏功能失调（体内脂“糖”代谢紊乱，这里糖为广义的糖，包括单糖、双糖、多糖），致气血不归正化，而产生痰瘀，并互结为患，又加重脾肝肾功能失调，互为因果，形成恶性循环。其主要治法是益气活血、健脾化痰、化瘀通络。冠心病属中医学“胸痹心痛”病范畴，历代医家重视“阳微阴弦”理论。赵淳教授结合现代气候、环境、饮食结构、工作生活方式、体质等的变化，认为诸邪化热、热毒致瘀、瘀阻心络是冠心病的主要病机之一。患者体内的肥甘、膏脂形成痰毒、瘀毒等蓄积蕴结，变生热毒，败坏形体、损伤心与心络，导致胸痹心痛的各种病理演变。芪蛭通脉颗粒即是在该理论的指导下，结合民族医药经验创制的治疗高脂血症、动脉粥样硬化性心脑血管病患者安全有效的验方。芪蛭通脉颗粒由炙黄芪、水蛭粉、三七、红曲、灯盏细辛组成。方中君药黄芪益气补中，补益胸中大气，臣药水蛭破血通经，逐瘀消瘕，含有抗血栓作用活性物，三七活血化瘀、消肿定痛。佐药红曲健脾消食，活血化痰。使药灯盏细辛有活血通络止痛，祛风散寒之功效。全方具有益气活血、化瘀通络之功效。现代药理研究发现，本方中黄芪可增强体液免疫功能，增强细胞免疫功能，改善心功能，具有调节血糖，抗衰老作用；水蛭有抗凝血，直接抑制凝血酶，促纤溶，改善血流变学，抗血栓形成，溶栓，抗血小板聚集，降低血液黏度，调节血脂，稳定逆转动脉粥样硬化斑块，增加心肌营养血流量，改善局部血液循环等综合抗凝、抗栓作用；三七有散瘀止血、消肿定痛、抗血栓、促进造血、扩血管、降血压、抗心肌缺血、抗脑缺血、抗心律失常、抗动脉粥样硬化等作用；红曲是细胞自身产生的天然氧化剂，能抑制线粒体的过氧化，有保护生物膜结构完整性的功能，可降低内源性胆固醇，加速胆固醇代谢，调节载脂蛋白质，保护改善血管内皮功能，改善心肌重构，改善心肌舒缩功能，有利尿、提高免疫功能、抗肿瘤、增强心肌收缩力等作用；灯盏细辛有改善血液流变学作用，防治心肌梗死后再灌注损伤，改善脑缺血，微血管内皮细胞保护。

LDL-R是LDL主要的受体，是肝脏组织表达最为丰富的膜糖蛋白，介导了肝脏细胞对脂蛋白的代谢和摄取，在脂蛋白代谢中具有十分重要的意义，是脂蛋白代谢的重要干预靶点，是调节机体血脂水平的重要因素［10-11］。肝脏是发生受体介导的LDL-C清除的主要场所［12］。PCSK9能够使血清中使血浆中LDL-C水平升高是基于其与LDLR结合，形成复合物，导致LDLR降解。PCSK9抑制剂可阻止LDLR降解，促进LDL-C的清除，目前市场上PCSK9抑制剂主要为PCSK9单克隆抗体。VCAM-1和ICAM-1是导致动脉粥样硬化进展的一种重要糖蛋白，容易引起单核细胞和内皮细胞发生黏附，进入内皮，分化成为巨噬细胞、泡沫细胞，最终导致动脉粥样斑块形成［13-14］。VCAM-1、ICAM-1过度表达与冠心病密切相关，VCAM-1促进炎症细胞与血管平滑肌细胞产生黏附，ICAM-1促使炎症细胞黏附于血管表面［15-16］。

本实验发现，芪蛭通脉颗粒低、中、高剂量组能够下调冠心病血脂异常，大鼠血清TC、TAG、LDL-C水平，升高血清HDL-C水平，表明芪蛭通脉颗粒有一定的调脂作用。芪蛭通脉颗粒可下调PCSK9、VCAM-1和ICAM-1表达，上调LDLR表达，表明其调脂作用可能是通过调控PCSK9/LDLR、VCAM-1/ICAM-1信号通路相关蛋白表达实现的，这为冠心病血脂异常的药物开发提供了一定的动物实验基础。