复方丹参滴丸治疗急性心肌梗死作用机制的网络药理学研究*

孟天伟 常 虹

（1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150036；2.内蒙古科技大学包头医学院，内蒙古 包头 014040）

急性心肌梗死（AMI）是以冠状动脉粥样硬化为主要机制，在此基础上，由于内膜损伤、血流变缓、血小板沉积等因素引起血栓形成，心肌供血进一步减少甚至中断，使心肌严重而持久地急性缺血，即发生心肌梗死［1］。另外，心肌耗氧量增加或冠状动脉痉挛也是诱发 AMI的条件因素［2］。AMI属于中医“真心痛”“厥心痛”的范畴，《灵枢·厥病》有云“真心痛，手足清至节，心痛甚，旦发夕死，夕发旦死”。由此可见该病具有病情重，病势急的特点。经过历代医家总结发现本病为本虚标实证，本虚主要是以气虚、阳虚、阴虚为主，其中心气虚、心阴虚最为常见。标实主要有血瘀、气滞、痰湿、寒凝，其中血瘀为该病最主要的病理特点，且常常夹杂于其他实邪之中。心阳亏虚，痰浊阻络引发心痛也是临床常见的一类症型［3］。

复方丹参滴丸是由丹参、三七、冰片3种药材经过现代工艺特殊加工制成的丸剂型中成药，具有活血化瘀，理气止痛的作用，对于气滞血瘀型冠心病，胸闷、心前区刺痛的心绞痛或心肌梗死患者具有较好的疗效。现代医学表明，复方丹参滴丸具有抗钙超载、抗炎、抗氧化、抑制血栓形成等作用。任宏强等［4］发现，复方丹参滴丸可通过降低AMI大鼠心肌细胞凋亡相关蛋白的表达水平来抑制AMI细胞凋亡。李建等［5］发现复方丹参滴丸能抑制AMI患者左心室重构，且副作用小。复方丹参滴丸是第一例通过美国认证的复方中成药，在其治疗AMI的众多研究中，更多的是对于复方丹参滴丸治疗AMI的单靶点、单通路的作用机制的相关研究。本次研究采用网络药理学的方法构建药物、靶点以及相关通路的网络图，将可能治疗疾病的相关靶点和通路展示，为后续的研究提供参考和依据。

1 资料与方法

1.1 复方丹参滴丸化学成分的获取及相关靶点筛选在中药系统药理数据库及分析平台TCMSP（https：//tc⁃mspw.com/tcmsp.php）以复方丹参滴丸中主要成分丹参、三七、冰片的名称为关键词进行检索，获取复方丹参滴丸中各化合物的相关信息。并以口服生物利用度（OB）≥30%，类药性（DL）≥0.18，半衰期（HL）≥4 h作为筛选指标，筛选出符合条件的有效成分。再通过Swiss Target Prediction［6］（http：//www.Swisstargetprediction.ch/）查找单个成分作用的靶点，将靶点输入至UniProt（https：//www.uniprot.org/）数据库中，校正基因名称。

1.2 急性心肌梗死相关靶点筛选 以“Acute myocar⁃dial infarction”为关键词通过DisGENET数据库（http：//www.disgenet.org/）以及 DrugBank数据库（http：//www.drugbank.ca/）检索疾病靶点，选取基因和疾病的相关性平均值以上的靶点，以保证此次研究的准确性。

1.3 复方丹参滴丸治疗急性心肌梗死的核心靶点筛选将药物靶点与疾病靶点映射获得相关治疗靶点，并将这些靶点输入STRING数据库（https：//string-db.org/）获得蛋白互作信息，筛选阈值高于0.900的高置信度互作信息。使用Cytoscape3.8.0［7］软件构建复方丹参滴丸与AMI疾病靶点网络，并通过软件中的Network Ana⁃lyzer功能进行网络拓扑分析，筛选节点自由度大于平均值的靶点作为核心靶点。

1.4 GO富集分析和KEGG通路富集分析 使用Omicshare（http：//www.omicshare.com/tools/index.php/）平台对核心靶点进行GO二级分类富集分析，物种选择“智人”运行获得生物过程，分子功能，细胞成分分析结果。利用DAVID平台（https：//david.ncifcrf.gov/）对核心靶点进行基因组百科全书KEGG（kyoto encyclope⁃dia of genes and genomes）通路分析，筛选P值<0.01，频次在10次或10次以上的条目，认为这些通路在复方丹参滴丸治疗AMI的过程中起到重要作用，以此来获得显著性较高的分析结果。

1.5 “化合物有效成分-靶点-通路”网络构建 利用Cytoscape 3.8.0软件对复方丹参滴丸化合物有效成分、核心靶点与通路之间的关系进行可视化处理，构建“化合物有效成分-靶点-通路”的网络药理图，以便于后续的分析研究。

2 结果

2.1 复方丹参滴丸化合物、活性成分及潜在靶点的收集与筛选 通过TCMSP筛选获得符合条件的丹参的化合物40个，三七的化合物7个，冰片的化合物3个。获得靶点1 965个，筛除重复后共获得靶点445个。将复方丹参滴丸中的50个化学成分以药物名称拼音加代号的方式代替，以便后续构图。对应列表如表1所示。

表1 复方丹参滴丸化合物成分汇总表

续表1-1

2.2 AMI靶点的筛选 通过DrugBank数据库共检索到疾病靶点数量为34个，DisGENET数据库共检索到疾病靶点数量为766个，以基因和疾病的相关性（Score_gda）的平均值为筛选标准，选择数值在0.0213以上的靶点共151个，两个数据库共获得靶点185个，筛除重复靶点后最终获得靶点数量159个。

2.3 复方丹参滴丸治疗AMI的核心靶点筛选 将药物靶点与疾病靶点映射后获得治疗靶点61个，通过“1.3项”的方法，获得靶蛋白相互作用网络如图1，运用Cytoscape3.8.0构建“药物成分-疾病靶点”网络，如图2所示。通过拓扑分析筛选出自由度大于平均值8.018的靶点24个，认为这些靶点为核心靶点，结果如表2所示，并构建“有效成分-疾病靶点”核心网络图，如图3所示。在网络中，某个节点的自由度代表在本网络中该节点与其他节点相互作用的数目，若自由度的值越大，则证明该节点的重要性越高，其中羧酸酯酶1（CES1）的自由度为23，是本网络中度值最大的靶点，因此复方丹参滴丸治疗AMI的过程中，该靶点起到关键作用。

表2 核心靶点

图1 复方丹参滴丸治疗AMI靶点PPI网络

图2 “复方丹参滴丸-有效成分-疾病名称-疾病靶点”网络图

图3 “有效成分-疾病靶点”核心网络图

2.4 GO富集分析与KEGG通路富集分析结果 复方丹参滴丸治疗AMI的GO富集分析如图4～图5所示。由图可知，这些核心靶点可以通过细胞的生物过程，细胞的代谢过程，细胞对刺激的反应等方面影响生物过程；通过离子结合、催化活性、分子功能调节剂等方面影响分子功能；通过细胞器、细胞膜、细胞膜部件、细胞外区等方面影响细胞组成。以P值<0.01，频次在10次或10次以上的条目为筛选条件，共筛选出复方丹参滴丸治疗AMI的KEGG通路富集分析25条，结果如表3所示。从表3可知，复方丹参滴丸治疗AMI可能与多种通路相关，可能通过调节癌症的途径、HIF-1信号通路、TNF信号通路等相关。利用Cytoscape对药物有效成分、核心靶点与通路之间的关系进行可视化处理，构建“化合物有效成分-靶点-通路”的网络药理图，如图5所示。在各通路中癌症通路自由度最大为21，该通路可能是复方丹参滴丸治疗AMI的关键通路。

表3 复方丹参滴丸治疗AMI的KEGG通路富集分析

图4 复方丹参滴丸治疗AMI的GO富集分析柱状图

图5 复方丹参滴丸治疗AMI的GO富集分析气泡图

3 讨 论

本次研究发现复方丹参滴丸通过丹参酮、积雪草酸、槲皮素等50种化合物共同作用于MAPK8、CASP3、CES1等24个核心靶点，并通过调节癌症的途径、HIF-1信号通路、TNF信号通路等发挥治疗AMI的作用。

丹参作用于AMI的有效化合物成分主要是酮类，丹参酮ⅡA具有降低AMI后心律失常的发生率、扩张血管的作用，从而降低心梗死亡率。单宏丽等［8］发现丹参酮ⅡA通过MAPK信号通路和SRF信号通路抑制miR-1从而改善心肌离子通道失衡，保护心肌。三七主要通过槲皮素等化合物，发挥着抗炎和抗动脉粥样硬化的作用。唐玉等［9］发现槲皮素通过抑制细胞间黏附分子表达，保护AMI患者的心肌。积雪草酸为冰片治疗AMI的主要化合物。史艳霞等［10］发现积雪草酸通过调节Nrf2/HO-1以及NF-κB来改善AMI大鼠的心肌损伤；荣霞等［11］发现积雪草酸抑制SIRT3/β-catenin/PPARγ信号通路可以对AMI大鼠的心肌组织起到一定的保护作用。MAPK8基因是MAP激酶家族中的一员。MAP激酶参与多种细胞过程如增殖、分化和转录调控。该激酶激活多种细胞刺激和目标特定的转录因子，从而调节即早期基因表达对细胞刺激的反应。有研究表明，MAP激酶对于T细胞的增殖、凋亡和分化发挥着关键作用。CASP3（半胱天冬酶3）在细胞凋亡中起着至关重要的作用，而细胞凋亡的失败是癌症的重要标志之一［12］。CES1是CES（羧酸酯酶）家族中的一员，CES属于药物代谢酶的第一阶段，该家族可以水解各种药物酯、酰胺、氨基甲酸酯和类似结构［13］。有学者［14］发现，一些功能CES1基因变异的（例如G143E）可能损害血管紧张素的激活，从而影响血管紧张素高活性化合物的治疗结果。

图6 化合物有效成分-靶点-通路

癌症通路涉及血管生成、细胞增殖等过程。癌症主要是由基因改变引起的，因为基因改变导致维持细胞动态平衡的基因调控网络紊乱。多数癌症是由各种环境因素造成的体细胞突变和生殖细胞突变共同作用引起的。然而，多数突变位于基因组位置上缺乏蛋白编码能力的区域，其中包括以RNA分子发挥功能的基因区［15］。HIF-1信号通路在多种心血管疾病、炎症等过程中发挥重要作用。HIF-1蛋白是缺氧状态下调控血管新生的重要分子［16-17］，HIF-1作为内源性保护分子在缺血缺氧性脑血管疾病、急性心肌梗死等疾病中对神经细胞的存活和心肌细胞的再生具有重要意义。万俊等［18］发现HIF-1α反义寡核苷酸对BMMSCs治疗AMI具有抑制作用，BMMSCs对大鼠AMI的部分治疗作用可能是通过HIF-1α介导的。TNF家族目前已经发现30多种细胞因子，研究表明TNF具有杀伤和抑制肿瘤细胞、提高中心粒细胞的吞噬抗感染等生物学活性，因此，TNF不仅是一种可引起肿瘤坏死的循环因子，同时也可被确定为调节炎症反应的关键因子。血管内皮细胞对TNF因子的反应是经历一系列促炎性改变，增加白细胞黏附、跨内皮迁移和血管渗漏，促进血栓形成［19］。

综上所述，本次研究充分证明复方丹参滴丸可以通过多个药物化合物成分作用于多个AMI靶点，再对有效靶点进行通路分析后发现复方丹参滴丸通过癌症的途径、HIF-1信号通路、TNF信号通路等多条通路对AMI进行治疗和调控。现阶段对于复方丹参滴丸治疗AMI的通路研究并不全面，而有些相关通路如：癌症的途径、TNF信号通路等并未被提及或研究。此次研究不仅佐证了前期对复方丹参滴丸治疗AMI的研究结论，同时研究出新的治疗AMI的靶点方向与相关通路，为后续的研究提供新的思路和方向。