补阳还五汤对局灶性脑缺血大鼠血液流变学及NLRP3/Caspase-1炎性反应的影响*

邵 乐 佘 颜 邓国倩 胡哲铨 易 健 刘 林 郭 纯 郭志华△ 吴其标

（1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；2.湖南中医药大学，湖南 长沙410208；3.澳门科技大学，澳门 999078）

缺血性脑卒中是严重危害人类生命健康的重大心脑血管疾病之一，数据表明，全世界每年新增脑卒中患者约1 690万人［1］。我国缺血性脑卒中患病率为1 762.77/1万［2］。体内存在促炎-抗炎平衡系统，脑缺血后的炎症失衡是导致神经细胞损伤的重要原因［3］，抑制脑缺血后炎症反应是治疗脑卒中的主要干预靶点［4］。缺血性脑卒中具有“虚、瘀”的中医病机特点，补阳还五汤为治疗气虚血瘀型脑缺血的经典名方。前期研究发现，局灶性脑缺血模型大鼠中白细胞介素-1β（IL-1β）、MCP-1、MIP-1α等炎症相关指标升高，存在明显的炎症稳态失衡，本研究通过观察补阳还五汤对MCAO大鼠大鼠血液流变学及NLRP3、Caspase-1的影响，进一步揭示其抗脑缺血炎症反应机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠100只，体质量（200±20）g，湖南斯莱克景达实验动物技术有限公司提供，合格证号：SCXK（湘）2012-0002。动物实验经湖南中医药大学第一附属医院实验动物伦理委员会批准。

1.2 药物与试剂 补阳还五汤组方：生黄芪120 g，当归尾6 g，赤芍4.5 g，地龙3 g，川芎3 g，桃仁3 g，红花3 g；由湖南中医药第一附属医院中药房提供，按《中国药典》相关要求制备煎煮液（2 g/mL），冷藏备用。所有药材均符合药典标准。盐酸米诺环素胶囊（瀚晖制药有限公司，批号：20091011）。NLRP3、Caspase-1、兔IgG即用型SABC免疫组化试剂盒、IL-1β、IL-18 ELISA测定试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）。

1.3 实验仪器 全自动型血流变分析仪（北京赛科希德科技发展有限公司，SA-6000），多功能酶标仪（美国Perkinelmer公司，Enspire），石蜡切片机（英国Shando公司，Finesse 325型），Bx51光学显微镜及IPP6.0图像分析系统（日本Olympus公司）。

1.4 模型制备 参照Longa与Knaga报道的方法［5-6］，采用大脑中动脉线栓法（MCAO）建立永久局灶性脑缺血大鼠模型。假手术组仅切开皮肤、分离颈总动脉后缝合。大鼠清醒后2 h参照文献［7］进行5级神经功能评分，分值在1～3分者入组。

1.5 分组及给药 大鼠随机分为假手术组、模型组、补阳还五汤组、米诺环素组，并分为1、3、7、14、28 d，共5个观察时间点，每组每个时间点各5只。各组造模后1 d后开始给药，根据动物-人体表面积换算法，补阳还五汤组及米诺环素组给药剂量为分别为3.15 g/kg、17.81 mg/kg，假手术组和模型组给予等体积生理盐水灌胃，每日1次，每组给药体积均为10 mL/kg。

1.6 标本采集与检测 1）血液流变学指标：大鼠以10%水合氯醛（3.0 mL/kg）麻醉后，用1%肝素真空抗凝采血管经腹主动脉取血4 mL，并将已取好的大鼠血液放入SA-6000全自动型血流变分析仪，检测全血黏度、红细胞聚集指数。2）脑组织NLRP3、Caspase-1表达：大鼠以10%水合氯醛（3.0 mL/kg）麻醉后，动物断头处死后，取各组大鼠脑组织，采用4%多聚甲醛固定，并经脱水、包埋、切片、封片等处理后，采用免疫组化法检测NLRP3、Caspase-1的阳性表达，按试剂盒具体步骤进行操作。每张组织切片随机观察5个高倍镜视野（400倍），计算平均光密度值。3）血清IL-1β、IL-18含量检测：大鼠以10%水合氯醛（3.0 mL/kg）麻醉后，经腹主动脉取血4 mL，3 000 r/min离心15 min，取血清置-80℃冰箱中保存待测。采用ELISA法测定血清IL-1β、IL-18含量，严格按试剂盒说明书操作。

1.7 统计学处理 应用SPSS21.0统计软件。计量资料以（±s）表示。组间比较若满足正态性检验、方差齐性，则使用方差分析，若不符合正态分布、方差齐性，采用非参数检验进行统计处理；组与组之间两两比较可采用LSD法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠全血黏度及红细胞聚集指数比较 见表1。与假手术组比较，模型组各时间点及补阳还五汤1 d组、米诺环素1 d组大鼠血液黏度显著上升，差异具有统计学意义（P<0.05）。用药3 d后MCAO大鼠血液黏度值开始下降，用药7 d后各组与模型组比较，差异具有统计学意义（P<0.05）。与米诺环素组比较，补阳还五汤组各时间点比较无差异（P>0.05）。补阳还五汤各时间点组内比较，用药7 d后大鼠全血黏度值下降明显，补阳还五汤组7、14、28 d时与1 d时比较差异具有统计学意义（P<0.05）。

表1 各组大鼠血液黏度及红细胞聚集指数比较（±s）

表1 各组大鼠血液黏度及红细胞聚集指数比较（±s）

注：与假手术组同时间比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组同时间比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01；与本组1 d时比较，★P<0.05，★★P<0.01；与本组3 d时比较，#P<0.05，##P<0.01。下同。

images/BZ_33_1248_2010_2252_2143.png6.08±2.02 8.40±1.37*8.27±1.10*8.50±0.29*8.37±1.55*8.59±1.16*8.58±0.71*7.72±0.55 7.35±0.84▲★6.96±0.70▲★6.50±1.01▲★★8.49±2.41*7.46±1.33 7.09±0.75▲6.54±0.88▲5.93±1.31▲-米诺环素组（n=5）假手术组模型组（n=5）1 d 3 d 7 d 14 d 28 d 1 d 3 d 7 d 14 d 28 d 1 d 3 d 7 d 14 d 28 d补阳还五汤组（n=5）5.23±0.49 6.32±0.82*6.06±0.65*6.19±0.63*6.48±0.91*6.37±0.84*6.43±0.57*5.95±0.40 5.76±0.29▲★5.62±0.55▲★5.43±0.55▲★5.90±0.83*5.80±0.55 5.37±0.36▲5.29±0.65▲5.19±0.69▲5.86±0.51 7.33±1.18*7.83±0.92*7.43±0.75*7.88±1.28*7.56±1.34*7.35±0.66*6.87±0.51 6.92±0.52▲6.31±0.78▲★6.06±0.82▲★6.77±0.70*6.54±0.52 6.16±0.50▲6.06±0.40▲5.57±0.85▲14.35±2.28 18.88±3.49*18.58±2.75*18.12±2.70*18.67±3.49*18.63±3.69*18.71±1.92*17.09±2.33 16.71±1.51▲★16.01±1.75▲★15.34±1.73▲★16.74±2.80*16.29±2.35 15.85±1.75▲14.09±1.19▲13.38±1.67▲38.06±3.42 44.31±5.18*45.42±4.66*46.78±6.21*47.78±5.87*46.41±7.73*47.89±3.73*43.26±4.45 42.78±4.61▲★41.24±5.87▲★40.82±5.68▲★45.12±3.82*41.94±3.49 40.51±4.65▲38.09±3.35▲37.50±3.52▲5.82±0.57 7.11±0.72*6.98±0.69*6.89±0.14*7.32±1.16*7.23±0.59*7.24±0.41*6.68±0.56 6.45±0.64▲★6.34±0.71▲★6.10±0.52▲★7.77±1.15*7.05±0.81 6.15±0.51▲6.05±0.66▲5.67±0.85▲

2.2 各组大鼠脑组织CA1区NLRP3表达的比较 见表2，图1。假手术组大鼠脑组织海马CA1区有少量NLRP3表达，模型组与用药组脑缺血损伤后NLRP3表达增加，并在1 d达到高峰，3、7、14、28 d呈下降趋势，但仍明显高于假手术组（P<0.05）。用药后，与模型组比较，补阳还五汤组及米诺环素组各时间点的NLRP3表达均有所下降，差异有统计学意义（P<0.05）。与米诺环素组比较，补阳还五汤组各时间点比较无明显差异（P>0.05）。补阳还五汤各时间点组内比较，用药7 d后大鼠NLRP3表达下降明显，补阳还五汤组7、14、28 d与1 d时比较差异具有统计学意义（P<0.05）。

表2 各组大鼠脑组织海马CA1区NLRP3表达的比较（平均光密度值，×10-3，±s）

表2 各组大鼠脑组织海马CA1区NLRP3表达的比较（平均光密度值，×10-3，±s）

组别假手术组模型组补阳还五汤组米诺环素组n 5 5 5 5 1 d 12.83±0.87 19.47±0.69*16.95±1.81*▲16.86±1.98*▲3 d 11.53±1.23 18.06±1.26*14.18±2.08*▲▲13.97±2.42*▲▲7 d 11.80±1.25 16.93±0.59*13.72±1.68*▲▲★13.81±1.26▲▲14 d 11.27±1.51 16.09±0.25*13.25±1.69*▲★13.80±1.71*▲28 d 12.17±0.61 15.18±1.04*13.09±1.06▲★12.97±0.94▲

图1 各组大鼠7 d时脑组织海马CA1区NLRP3表达（DAB染色，400倍）

2.3 各组大鼠脑组织海马CA1区Caspase-1表达的比较 见表3，图2。假手术组大鼠脑组织有少量Cas⁃pase-1表达，模型组与用药组脑缺血损伤后大鼠脑组织Caspase-1表达增加，并在3 d达到高峰，7、14、28 d呈下降趋势，但仍显著高于假手术组（P<0.01）。从用药7 d后始，米诺环素组Caspase-1表达有所下降，与模型组比较差异均具有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。与米诺环素组比较，补阳还五汤组各时间点比较差异无统计学意义（P>0.05）。补阳还五汤组内各时间点比较，用药7 d后Caspase-1表达下降明显，补阳还五汤组28 d时与1、3 d时比较差异具有统计学意义（P<0.05）。

表3 各组大鼠脑组织海马CA1区Caspase-1表达的比较（平均光密度值，×10-3，±s）

表3 各组大鼠脑组织海马CA1区Caspase-1表达的比较（平均光密度值，×10-3，±s）

组别假手术组模型组补阳还五汤组米诺环素组n 5 5 5 5 1 d 12.14±1.62 18.27±0.85*16.84±0.97*16.09±1.12*3 d 12.86±0.79 18.89±0.65*16.92±1.97*16.82±1.94*7 d 12.47±0.72 17.79±0.72*16.03±2.15*16.23±2.09*14 d 12.83±0.27 17.72±0.24*15.87±1.32*▲15.83±1.89*▲28 d 12.38±0.29 16.91±1.34*14.79±2.15▲▲★#15.07±1.32▲▲

图2 各组大鼠7 d时脑组织海马CA1区Caspase-1表达（DAB染色，400倍）

2.4 各组大鼠血清IL-1β含量的比较 见表4。脑缺血损伤后，血清IL-1β含量上升明显，并在3 d达到高峰，7、14、28 d呈下降趋势，与假手术组比较，各组各时间点差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。与模型组比较，用药7 d后起，补阳还五汤组及米诺环素组血清IL-1β含量明显下降，差异具有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。与米诺环素组比较，补阳还五汤组各时间点比较无明显差异（P>0.05）。补阳还五汤组内各时间点比较，用药7 d后IL-1β表达下降明显，补阳还五汤组28 d时与3 d时比较差异具有统计学意义（P<0.05）。

表4 各组大鼠血清IL-1β含量的比较（pg/mL，±s）

表4 各组大鼠血清IL-1β含量的比较（pg/mL，±s）

组别假手术组模型组补阳还五汤组米诺环素组n 5 5 5 5 1 d 82.16±23.72 185.81±21.25*180.95±18.96*182.77±23.84*3 d 85.91±34.24 237.22±31.61**216.31±31.94**208.61±36.91**7 d 89.63±27.15 256.22±51.32*203.22±29.58*▲205.42±36.59*▲14 d 92.87±31.35 228.05±27.69*171.08±25.85**▲167.25±35.81**▲28 d 88.32±38.77 215.62±41.57*151.96±16.33**▲▲#148.81±37.22*▲▲

2.5 各组大鼠血清IL-18含量的比较 见表5。脑缺血损伤后，血清IL-18明显上升，术后1 d即达到高峰，随后呈下降趋势，与假手术组比较，模型组各时间点及用药组1、3、7 d差异具有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。与模型组比较，用药1d后起，补阳还五汤组及米诺环素组血清IL-18含量明显下降，差异具有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。与米诺环素组比较，补阳还五汤组各时间点比较无明显差异（P>0.05）。补阳还五汤各时间点组内比较，用药7 d后大鼠IL-18表达下降明显，补阳还五汤组14、28 d时与1 d时比较差异具有统计学意义（P<0.05）。

表5 各组大鼠血清IL-18含量的比较（pg/mL，±s）

表5 各组大鼠血清IL-18含量的比较（pg/mL，±s）

images/BZ_35_165_1164_1169_1231.png假手术组模型组补阳还五汤组米诺环素组5 5 5 5 116.24±13.63 259.64±16.23*198.35±66.42*▲186.33±78.74*▲113.43±18.52 264.92±52.77*186.87±73.47*▲178.28±55.82*▲124.32±9.81 249.25±51.74*160.68±62.11*▲164.21±32.11*▲118.56±10.77 235.24±42.88*139.22±49.12▲▲★129.88±42.31▲▲109.63±14.65 231.87±37.33*133.34±35.66▲▲★128.61±57.21▲▲

3 讨 论

缺血性脑卒中属中医学“中风”范畴，其病位在脑，为本虚标实之证，本虚为正气虚损，标实为瘀阻脑络，具有“虚、瘀”的基本病机状态，气虚血瘀是其发病的关键。人到中年，脏腑功能减退，五脏皆虚，此为正气虚损。气机升降失调，“气为血之帅”，气虚推动无力，血行迟缓，阻滞于脉络，则成血瘀，瘀停于脑，此为瘀阻脑络。从现代医学角度研究发现，血瘀证主要表现为血液流变学异常、血流动力学改变［8］、血栓形成［9］及动脉管腔狭窄［10］，而这正是缺血性脑卒中的基本病理基础，随着现代医学的发展，研究发现，炎症和血瘀证在疾病过程及治疗上密切相关，血瘀证在某些细胞因子、临床治疗及动物模型方面与炎症存在着密不可分的联系［11-12］，因此我们认为，脑缺血再灌注的“虚、瘀”中医病机状态与神经炎性损伤密切相关。

NLRP3炎症小体属于机体内识别模式受体（PPRs）NLR样受体，主要在免疫炎症细胞中表达，在免疫炎症反应中起重要作用［13］。NLRP3炎症小体由NLRP3、接头蛋白ASC和前体Caspase-1组成。ASC为NLRP3炎性小体的一种重要接头蛋白，连接上游NLRP3及下游前体Caspase-1。Caspase-1为NLRP3炎性小体的效应蛋白，其前体Caspase-1本身无催化活性，生理情况下，以无活性的形式位于静息细胞的胞浆中，NLRP3炎症小体激活后，前体Caspase-1可通过自身催化激活，激活后可促成IL-1β、IL-18等炎症因子的活化［14］。本研究结果也证实，脑缺血损伤大鼠在缺血后1 d即出现NLRP3升高并达到峰值，Caspase-1的表达在脑缺血后3 d达到峰值，进一步证实了MCAO大鼠中存在NLRP3炎症小体活化，其活化过程与文献研究一致。

补阳还五汤是治疗气虚血瘀型脑缺血的经典名方，临床疗效独特［15-16］，该方重用生黄芪补气，令气旺血行，瘀去络通，为君药。当归尾长于活血，是为有化瘀而不伤血之妙，为臣药。川芎、赤芍、桃仁、红花助当归尾活血祛瘀；地龙通经活络，均为佐药。全方共奏益气活血，通经活络之功。课题组前期研究发现，其药效物质主要来源为黄芪、川芎当中的川芎嗪、阿魏酸、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、洋川芎内酯A、蒿本内酯。而黄芪为治气虚要药，川芎为血中之气药，表明补阳还五汤对“虚、瘀”状态的缺血性脑卒中疗效确切。前期药效学实验表明补阳还五汤可改善MCAO大鼠神经功能缺损症状，其作用机制与抗炎症反应、抗氧化应激损伤等有关［17-19］。证实了补阳还五汤可通过多靶点、多环节、多效应途径有效防治脑缺血。本实验结果也证实，补阳还五汤可有效改善MCAO大鼠血液流变学指标，抑制NLRP3、Caspase-1表达，减轻炎症反应，因此，我们推测，NLRP3炎症小体的过度活化是脑缺血炎性损伤加重的重要因素，补阳还五汤可能是通过抑制NLRP3、Caspase-1表达，从而减轻脑缺血后炎症反应，发挥抗脑缺血损伤的作用。