研究在手足口病标本检测中不同分子生物学方法的应用效果

王鲲

北大医疗鲁中医院检验科，山东淄博 255400

手足口病多发生在5 岁以下的儿童中， 导致患儿发生此病的主要因素为多种肠道病毒，患儿发病后，出现手、足、口腔等部位的皮疹问题，同时伴随发热症状，严重时患儿会出现无菌性脑膜脑炎， 肺水肿和心肌炎等问题，对患儿的生命健康造成严重威胁。 在临床发展中，随着医疗技术的不断发展推进，其已经明确导致患儿发病的主要病原体为柯萨奇病毒A16 型和肠道病毒71 型，在此基础上，对患儿进行诊断，将分子生物学检测方法进行应用，可实现对手足口病标本的有效检测，保证对患儿病情进行判断，给予患儿及时治疗，避免病情加重[1]。 但是不同分子生物学的检测方法对应的检测结果不同， 该研究方便选取该院2019 年12 月—2020年12 月期间接受检测的150 例患者进行研究，将3 种检测方法进行应用，探究其检出结果，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

为探究不同生物学标本在手足口病患者中的应用效果，该研究采用对照法，方便选取150 例手足口病患儿，根据患儿病情严重程度将其分为3 组，分别为重死患儿组、轻症患儿组和住院患儿组，将其命名为甲组，乙组和丙组， 均为50 例。 甲组患儿中男24 例， 女26例；年龄1～5 岁，平均年龄为（2.56±1.03）岁。 乙组患儿中男23 例，女27 例；年龄1～6 岁，平均（2.74±1.22）岁。丙组患儿中男25 例，女25 例；年龄1～5 岁，平均（2.13±1.28）岁。 3 组患儿的一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。 具有可比性。

纳入标准：患儿均被确诊为手足口病，与相关疾病诊断标准相符合； 患儿存在不同程度的发热和手足皮疹，口腔溃疡等症状；患儿伴随一定程度的中枢神经系统症状；患儿家属均知情并愿意参与研究；该研究均通过医院伦理委员会批准。

排除标准：患儿具有精神病史；患儿存在其他重大疾病；患儿依从性较差。

1.2 方法

应用无菌操作方法，采集手足口病患儿标本，主要采集发病后3～7 d 内的患儿标本，以粪便为主，采集重量为1～2 g，将采集到的标本放置在密封的大便盒中进行保存。 同时应用专用的棉签，对患儿的咽两侧扁桃体部位和咽喉壁进行擦拭，保证力度适中，注意避免与喉部造成接触， 在完成擦拭后， 可将棉签插入到采样管中，其采样管型号为Hank，为3 mL，随后将试管进行密封。 将该研究所采集的标本放入到冰箱中， 温度控制在-80℃，以便于有效检测。随后，应用不同检测方法，分别为实时RT-PCRZ 法，一步法RT--PCRZ 和巢式PCR法，在检测过程中，主要应用Promega 公司的PCR 法扩增仪和试剂盒，应用相关软件排列EV71 和CA16 引物序列， 并对检测条件进行有效选择， 实现对标本的检测。 并对其反应条件进行有效控制，主要控制在45℃，对其进行逆转录，时间为45 min。 在温度为94℃时，给予其退火干预，时间为25 s，在其71℃的环境中对其进行延伸处理，时间控制在30 s，共进行36 个循环。最后，应用荧光PCR 仪，型号为ABI7500，对实时RT-PCRZ法的检测结果进行分析。 对一步法RT--PCRZ 和巢式PCR 法的结果进行检测， 主要将浓度为1.5%的制糖凝胶电泳进行应用分析， 随后对3 组的检测结果进行分析比较。

1.3 观察指标

对3 组检出标本EV71 和CA16 病原阳性率进行计数。

1.4 统计方法

采用SPSS 20.0 统计学软件进行数据分析，计量资料以（±s）表示，组间差异比较以t 检验；计数资料以频数及百分比（%）表示，组间差异比较以χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

甲组患者中3 种检测方法的EV71 检出阳性率分别为80.00%、22.00%和80.00%， 乙组患者的EV71 检出阳性率分别为46.00%、8.00%和16.00%，而丙组患者的EV71 阳性检出率则分别为86.00%、26.00%和86.00%， 一步法RT--PCRZ 的检出阳性率与实时RTPCRZ 法和巢式PCR 法的检出率比较差异有统计学意义（P＜0.05），无论是在重死患儿，轻症患儿还是住院患儿中，一步法RT--PCRZ 的阳性检出率均相对较低，与其他两种检测方法比较差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 3 种检测方法在手足口病阴性检测结果中的应用[n(%)]

3 讨论

就手足口病患者来说，其表现为出疹性疾病，导致患儿发病的病原体大多为人肠道病毒属， 微小核糖核酸病毒科，具有20 多种类型，其中最为常见的是EV71和CA16 病原体[2]。 手足口病多发生在5 岁以下的儿童中，患儿发病后，出现手、足、口腔等部位的皮疹问题，同时伴随发热症状， 严重时患者会出现无菌性脑膜脑炎，肺水肿和心肌炎等问题，对患儿的生命健康造成严重威胁。手足口病是一种全球性传染病，1957 年开始出现， 最早由Seddon 进行描述， 在随后的发展中，1958年，意大利Robinson 从HFMD 患者中将CAV16 分离出来，在随后的报道中，几乎所有结果均显示手足口病与CA16 相关。 发展到1974 年，美国学者则在脑炎患者中分离出EV71 肠道病毒，从此手足口病的医学研究中加强了对EV71 感染问题的重视程度，此后，EV71 感染和CA16 感染交替发生，在手足口病患者中成为了主要病原体。 在近些年的发展中，我国手足口病的患儿发病率逐渐升高，临床病死率增加，对患儿的生命健康造成了严重威胁。 患儿在患病后，会受到其年龄相对较少，自身发育不完全等因素的影响，导致其抵抗力相对低下，在一定的程度上增加了患儿的诊断和治疗难度[3]。 因此，需要检测手足口病标本病原体，保证及时发现患儿病情，从而进行针对性治疗，减少患儿不良反应发生率[4]。从临床目前的发展情况来看，对患儿进行诊断的分子生物学检测方法较多，主要包括实时RT-PCRZ 法、一步法RT--PCRZ 和巢式PCR 法， 在实际使用过程中，不同方法所对应的检测敏感性和特异性差异较大， 需要对其展开进一步分析，从而明确有效的诊断方法，提高临床诊断准确性[5]。

相关研究人员在工作开展过程中， 主要将3 种诊断方法进行应用， 分别为实时RT-PCRZ 法、 一步法RT--PCRZ 和巢式PCR 法， 人员对200 例手足口病进行了标本检测， 结果显示3 种检测方法对应的阳性率分别为160 例 （80.00%）、88 例 （44.00%） 和168 例（84.00%）， 表明实时RT-PCRZ 法和巢式PCR 法的临床检测敏感性更高[6]。 实时RT-PCRZ 法主要是指在一定的时间内，通过对病原体DNA 的增幅，实现对病原体阳性的检测， 而一步法RT--PCRZ 则是通过进行DNA 链的逆转录，实现互补DNA 的生成，随后将PCR进行应用，实现对新的DNA 链的有效复制，从而使其DNA 链得以有效扩增，并展开进一步的分析[7]。 而巢式PCR 法， 其在实际实施过程中， 主要是先与目标DNA模板中蓝色的第一对引物进行结合， 从而保证将目的片段进行获取，在此基础上，将2 套引物进行扩增，从而经过PCR 扩增，在将扩增产物进行分析时，得出病原体数据[8]。

该研究工作在实际开展过程中， 分别为实时RTPCRZ 法， 一步法RT--PCRZ 和巢式PCR 法进行了应用， 在150 例手足口病的标本检测结果中， 分必有50例重死患儿，50 例轻症患儿和50 例住院患儿， 对其进行标本检测， 结果显示： 甲组患者中3 种检测方法的EV71 检出阳性率分别为80.00%、22.00%和80.00%，乙组患者的检出阳性率分别为46.00%、8.00%和16.00%，而丙组患者的EV71 阳性检出率则分别为86.00%、26.00%和86.00%，一步法RT--PCRZ 的检出阳性率与实时RT-PCRZ 法和巢式PCR 法的检出率存在显著差异，无论是在重死患儿，轻症患儿还是住院患儿中，一步法RT--PCRZ 的阳性检出率均相对较低， 与其他两种检测方法比较差异有统计学意义（P＜0.05），与其他研究成果相一致，表示实时RT-PCRZ 法和巢式PCR 法的检出率更高，临床应用意义更为显著。 与此同时，在对不同检测方法的检测结果进行分析时， 还可以看出EV71 达到发生在重死患儿和住院患儿中， 而CA16 则在轻症患儿中占有较大比例[9]。

一步法RT--PCRZ 主要是指将一条DNA 链进行逆转录，在此过程中，促进互补DNA 的生成，随后再以新形成的DNA 链通过PCR 进行复制， 从而促进有效扩增，实现工作目的。 实时RT--PCRZ 则是促进基因在一段时间内通过DNA 进行增幅，进而展开进一步的定量分析[10-11]。

临床发展现状中，还有巢式PCR 法的应用，此技术在近些年发展起来，并在临床中得到了广泛应用。 此技术在实际使用过程中，主要分为两步实施，第一步是促进DNA 模板蓝色的第一对引物相集合，同时获得目的片段，第二步则是将第二套引物进行应用，将其第一步中经过PCR 扩增的产物进行第二次扩张， 在其技术的实际使用过程中， 受到其第一套引物在CPR 的内部因素影响，这一段过程并非是目的片段，在一般情况下，不会同时包含两套引物， 在进行第二步扩增工作的过程中，其并不存在非目的片段的扩增情况[12-14]。 因此，在将这一技术方法进行应用的过程中， 非特异性扩增问题的发生频率较低， 因此问题而导致的感染问题发生率也相对较低，在一定程度上增加了其应用特异性，是目前发展过程中，促进质量增加的主要方法，而且其所对应的监测效果较好。 因此，临床在针对手足口病患儿进行标本采集时，需要根据患儿的实际情况，选择合适的方法，保证符合临床发展需求，为手足口病患儿的诊断提供有效依据，保证诊断有效性，从而促进临床治疗方法的实施，提高临床治疗有效率，其对提高患儿家属满意度，促进医院发展均具有重要的积极意义[15]。

此外，在将一步法RT--PCRZ 和巢式PCR 法进行应用时，还需要采用电泳辅助检查，在其实际使用过程中，很容易导致标本受到污染，在具体操作时，过程较为复杂，需要较长的检测时间，对检测效果的影响较大，容易降低检测准确率[16]。而实时RT-PCRZ 法的应用，不仅操作过程较为简便，易于上手，而且对于污染物的控制效果相对较好，可对结果进行直观分析，很少会出现假阳性问题， 在一定程度上提高了相关检测方法的诊断有效率，因此其在临床中的应用范围更为广泛[17-18]。

综上所述，在对手足口病患儿的标本进行检测时，不同检测方法对应的检测效果不同， 可将实时RTPCRZ 法和巢式PCR 法进行应用，其效果显著，检出率更高，可保证对患儿病情的有效诊断，保证早诊断、早治疗，减少患儿不良反应发生率，促进患儿生命健康，可在临床推广使用。