普通PCR与巢式PCR检测生殖器疱疹病毒的对照

王秀梅,陈世义*,于海滨,刘玉洁

(1.吉林大学第一医院 皮肤科,吉林 长春 130021;2.北京佑安医院皮肤科,北京 100054)

普通PCR与巢式PCR检测生殖器疱疹病毒的对照

王秀梅1,陈世义1*,于海滨2,刘玉洁1

(1.吉林大学第一医院 皮肤科,吉林 长春 130021;2.北京佑安医院皮肤科,北京 100054)

*通讯作者

生殖器疱疹(GH)是由单纯疱疹病毒(HSV)引起性传播疾病(STD),GH典型表现临床上诊断并不困难,但对于不典型表现容易漏诊或误诊。HSV主要通过生殖器或肛门、呼吸道、口腔粘膜的分泌物传播。以往病毒培养被看做GH诊断的金标准,但需要约2周的时间,相比之下,普通PCR用不到2小时的时间,敏感性和特异性高于病毒培养,且检测HSV的同时,对其进行分型。近来巢式PCR以其较高的灵敏度与特异性在临床检验中逐渐开展.普通PCR与巢式PCR分别检测HSV二者关系如何,现就此作初步的探讨。

1 材料和方法

1.1 临床资料 标本为我科性病门诊就诊、按卫生部标准诊断为GH的254名病人,男142人,女102人,年龄18-62岁,平均28.6岁。复发频率3次/月-1次/6月,病程 1天-6年.＜5天者128例,5-10天者64例,＞10天者62例。皮损形态:水疱90例,糜烂108例,结痂56例。

1.2 主要仪器与试剂 美国MGResearch PCR扩增仪PTC-100,德国Heraeus高速台式离心机,中国FX-302暗箱式紫外检测分析仪,美国PROMEGA公司产琼脂糖、Taq 酶、DNTP。

1.3 取材 用生理盐水清洁水疱处皮肤,用棉拭子取水疱处疱液;皮疹为糜烂、溃疡或结痂者,先用钝刀去除表面的分泌物、痂皮、痂屑,轻刮(以不出血为度)糜烂、溃疡基底部,再用棉拭子轻擦皮损表面(尤其边缘部位),置-20℃冰箱中保存备用。

1.4 处理方法

1.4.1 处理PCR标本 将冷冻融化或新采集后的标本置于1 ml生理盐水Eppendorf管中,贴壁挤出拭子中的水分,弃拭子,15 000 rpm 4℃离心 10 min,弃上清,将 50 μ l蛋白酶 K 裂解液(含 0.5%NP-40、0.5%TWEEN20、蛋白酶K 1 μ g/μ l)加入至沉淀中,充分振荡混均后56℃水浴2 h,煮沸10 min,15 000 rmp离心10 min,取5 μ l上清液作为反应模板。

1.4.2 巢式PCR和普通PCR反应 (1)参照S.Jain设计根据已知的HSV-1 gpD基因序列合成两对引物:HSV-1A甲5'-ATCACGGTAGCCCGGCCGTGTGTGACA-3'HSV-1 gpD 19-43 nt;HSV-1 A乙5'-CATACCGGAACGCACCACACAA-3'HSV-1 gpD 218-239 nt;HSV-1 A丙5'-CCATACCGACCACACCGACGA-3'HSV-1 gpD 51-71 nt;HSV-1A丁5'-GGTAGTTGGTCGTTCGCGCTGAA-3'HSV-1 gpD 166-188 nt。

引物A甲、A乙扩增片段为221 pb;引物A丙、A丁扩增片段为138 bp。

(2)参照S.P.V.Cogle设计据已知的HSV-2gpG基因序列合成两对检测HSV-2引物:HSV-2 B甲 5'TCAGCCCATCCTCCTTCGGCAGTA-3'HSV-2 gpG 363-386 nt,HSV-2 B乙5'-GATCTGGTACTCGAATGTCTCCG-3'HSV-2 gpG 524-546 nt;HSV-2 B丙5'-AGACGTGCGGGTCGTACACG-3'HSV-2 gpG 422-441 nt;HSV-2 B丁5'-CGCGCGGTCCCAGATCGGCA-3'HSV-2 gpG 503-522 nt。

引物B甲和B乙的扩增片段为184bp,引物B丙和B丁的扩增片段为101 bp。

(3)普通PCR与巢氏PCR反应系统:总反应液体量 25 μ l,其中 10×PCR 缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl,50 mmol/L KCl)2.5 μ l,dNTp 、引物 5pmol各 0.2 mM,3.5 mM MgCl2,待检测样品 5 μ l,TaqDNA 聚合酶(1 U/1 μ l)1 μ l,其余用双蒸水补足,混匀后加入50 μ l液体石腊,设加标准样模板的阳性对照和不加模板的阴性对照。第一次PCR反应用引物A甲,A乙,B甲,B乙;93℃30 s,55℃60 s,72℃60 s,循环 35次,最后一个循环于72℃充分延伸5分钟。第二次PCR反应引用产物为A丙,A丁,B丙,B丁,取0.5 μ l模板为第一次PCR的扩增产物,于93℃预变性2 min,93℃30 s,55℃60 s,72℃60 s,30个循环后72℃充分延伸5 min,常规PCR同第一次反应。

(4)判定结果:取10 μ l PCR反应产物,2%琼脂糖浆上电泳(含10 μ g/ml溴化乙锭),紫外线分析仪观察反应结果,第一次PCR反应HSV-1、HSV-2分别出现221 bp、184 bp,第二次反应HSV-1、HSV-2分别出现 138 bp、101 bp。

1.5 统计学处理 采用 χ2检验。

2 结果

2.1 254名检测的患者中,普通 PCR检测220(86.61%)例阳性,而巢式PCR检测242(95.28%)例阳性。和普通PCR相比,巢式PCR可以检测出普通PCR阴性的22(8.66%)例患者。在巢式PCR检测阳性的242名患者中61(25.2%)名为HSV-1感染,181(74.8%)名为HSV-2感染,普通PCR所对应的结果分别为54(24.5%)、166(75.5%)。(见表1)

表1 两种方法检测HSV及分型

2.2 242名HSV阳性的患者中,161(66.5%)名为初次感染,其中 53(32.9%)名由HSV-1引起,108(67.1%)名由HSV-2感染引起;81(33.5%)名为复发型生殖器疱疹,其中8(9.9%)名为HSV-1引起,73(90.1%)为HSV-2感染引起。(见表2)

表2 巢式PCR检测原发型与复发型生殖器疱疹HSV比较

3 讨论

在254名患者中,巢式PCR检测 242名患者HSV阳性,而普通PCR检测出220名,由此可以看出巢式PCR的敏感性更高。两者差异有统计学意义。没有一例患者普通PCR阳性巢式PCR阴性,显示出巢式PCR的特异性为100%。巢式PCR可以检测出普通PCR为阴性的64.7%HSV感染的患者。

在普通PCR阳性的220名患者中,54(24.5%)由HSV-1引起,166(75.5%)由HSV-2引起;巢式PCR阳性的242名患者中,61(25.2%)名由SHV-1引起,181名(74.8%)由HSV-2感染引起。在此项研究中这两种检测手段的分型相似,四分之三的生殖器疱疹由HSV-2感染引起。四分之一的生殖器疱疹由HSV-1感染引起,这与国际报道的有所差异[1],可能与地域因素或选择的病例不同有关。在一项研究中表明由HSV-1引起的GH在大学年轻人中已增长至78%[2]。虽然由HSV-1引起的GH症状较严重,但复发的频率、无症状排毒次数比HSV-2引起者少,且确诊 1年后很少复发[3],临床上容易控制;HSV-2引起者,由于频繁复发,导致情绪变化,加重心理负担。HSV-1引起的GH可能防止HSV-2的感染[4],而只感染HSV-2的人比同时感染HSV-1、HSV-2的人发生生殖器溃疡的可能性大[3],由此推断感染HSV-2的人感染、传播性病的可能性更大。

巢式PCR对原发性和复发性GH检测及分型的结果支持由HSV-1引起的生殖器疱疹比HSV-2引起的有更低的复发率,预后较好。临床上支持GH诊断的12(4.72%)名患者巢式PCR检测为阴性。12名患者中,1名患者发现有原发性梅毒的感染,2名患者有外伤引起的生殖器溃疡的病史。

这项研究表明,巢式PCR以更高的灵敏度与特异性更适于HSV的检测。对单纯疱疹病毒检测的同时对其进行分型对GH的防治有重要意义。

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1007-4287(2010)01-0118-02

王秀梅(1983-),女,硕士研究生,主要研究方向为皮肤病与性病诊治。

2009-06-15)