PAX1 甲基化检测对于非16/ 18 型高危型人乳头瘤病毒感染人群的临床研究

林珺，黄勉，金琼，沈张，吴三山

福建医科大学附属福州市第一医院妇科，福建福州 350009

现阶段人乳头瘤病毒（HPV）疫苗正逐步在中国普及，且均覆盖了HPV16/18 型，阴道镜检和宫颈活检也可直接明确HPV16/18 型阳性诊断[1-3]。 但对于非16/18型高危人乳头瘤病毒（HR-HPV）阳性人群，现有筛查策略存在一定程度的不统一性， 伴随漏诊风险及门诊量负担重的问题[4-5]，同时长期随访已使患者产生过度担忧罹患宫颈癌的心理[6-9]。 因此，优化非16/18 型HRHPV 阳性人群筛查策略， 尽量减少目前筛查策略的弊端，十分必要。 近年来，宫颈癌的研究热点逐渐包括了DNA 甲基化，且取得了很大进展。PAX1 是PAX（paired box）配对盒基因家族之一，参与调控细胞内的信号转导[8-10]，目前PAX1 基因甲基化在宫颈鳞状细胞癌患者的改变已被多篇国际期刊验证[10-11]。 该研究在福州市第一医院2016 年6 月—2020 年6 月持续感染1 年以上的267 例非16/18 型HR-HPV 阳性人群进行PAX1 甲基化基因检测， 并同时进行阴道镜检查与病理切片比对，截止到2020 年6 月，拟探讨PAX1 甲基化基因检测对于非16/18 型HR-HPV 阳性人群的诊断价值， 为宫颈癌筛查工作提供新思路， 以减轻福州市医院门诊量负担。 现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

方便选取就诊于该院妇产科267 例HR-HPV 检测为非16/18 型 （即31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68 型）HR-HPV 阳性的女性患者，入组，按两种策略进行筛查，分别进行PAX1 检测、TCT 检测。所有研究对象均进行阴道镜检查及组织学切片。 以病理检查结果为诊断的金标准。 所有女性进行问卷调查、病情告知，并亲属知情同意书， 并通过伦理委员会审查。 纳入标准：①年龄＞21 岁的女性，有性生活史；②自愿加入该研究； ③按照标准操作取样，HPV 检测均为仅非16/18 型HR-HPV 阳性。 排除标准：①曾因宫颈癌及癌前病变或其他女性生殖系统恶性肿瘤而接受治疗者； ②临床标本项目缺失者；③接种过宫颈疫苗者；④孕产妇及哺乳期妇女；⑤已行全子宫切除术者。

1.2 方法

PAX1 基因甲基化检测：①根据湘雅检验所科学研究在启动子近端存在数十个CpG 邻近位点，建立PAX1引子对并完成相关测试与切片比对之最佳引子对作为此次试验基石。 ②按照QIAamp DNA Mini Kit（250）试剂盒说明提取基因组DNA，并对基因组DNA（0.6～1 μg）进行亚硫酸盐修饰，中提及为20 μl，-20℃保存。③启动子基因扩增：PAX1 甲基化特异性的PCR （methylationspecific polymerase chain reaction，MS-PCR）取亚硫酸氢盐修饰后DNA 1 μl 为范本， 以宫颈癌细胞株Shiha,HelaDNA 为阳性对照，水为阴性对照，PCR 反应体系为25 μl，范本DNA 1 μl，上下游引物各1 μl，DMSO1.2μl，2×TaqPCR Master Mix 12.5 μl，最后加去离子水补齐至25 μl第一轮扩增循环参数：94℃3 min 后，94℃30 s，46～53℃50 s，72℃1 min，27 次循环，72℃延伸10 min。 第二轮扩增参数：94℃3 min 后，94℃30 s，58～65℃50 s，72℃1 min，37 次循环，72℃延伸10 min。 检测结果为阳性者转诊阴道镜，阴性者随访。

TCT 细胞学检测：①标本采集：暴露宫颈，收集子宫颈上皮细胞样本，置于装有细胞保护液的新柏氏（Thin-Prep）细胞采集瓶中。 ②薄片制作：制片及检测。 ③细胞学诊断： 采用2001 年国际癌症协会 （NCI） 推荐程度TBS 分级系统：正常、慢性炎症等简易判断为正常，病变组为无明确意义的非典型鳞状细胞的改变 （ASC-US）及以上病变，包括ASC-US、不典型腺细胞（AGC）、低度鳞状上皮内病变（LSIL）、高度鳞状上皮内病变（HSIL）、高度病变的不典型鳞状细胞（ASC-H）。 检测结果为阳性者转诊阴道镜，阴性者随访。

阴道镜病理学检查：对3%醋酸和碘试验不着色区域进行多点活检，并送病理检查。 阳性结果分为宫颈上皮内瘤样变（CIN）及宫颈癌。

1.3 统计方法

数据分析应用SPSS 23.0 统计学软件进行统计分析，以病理切片当成金标准以统计分析计算。 计数资料采用[n(%)]表示，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者基本资料分析

267 例非16/18 型HR-HPV 患者参与该研究，年龄20～75 岁，平均年龄（47.25±5.18）岁，267 例患者均进行病理活检，正常或炎症结果为124 例（46.44%），CIN3 及以上53 例（19.85%），液基细胞学检查（LBP）结果正常141 例（52.80%），ASC-US/AGC 96 例（35.96%），ASC-H为20 例（7.49%），LSIL 及以上10 例（3.75%），基本资料见表1。

表1 患者基本资料

2.2 检测结果分析

2.2.1 两种筛查方法的诊断效能分析以病理切片结果为金标准，CIN3 及以上病变为分界点，CIN3+为阳性，CIN3-为阴性，PAX1 检测的灵敏度为92.50%， 特异度为43.90%， 阳性预测值为28.99%， 阴性预测值为95.92%，差异有统计学意义（Kappa=0.200，P＜0.05）；TCT检测的灵敏度为96.20%，特异度为14.00%，阳性预测值为21.70%，阴性预测值为93.75%，差异有统计学意义（Kappa=0.045，P=0.040）。 两种筛查方法比较TCT 的灵敏度高于PAX1 检测 （96.20%＞92.50%），PAX1 检测的特异度高于TCT 检测（43.90%＞14.00%），PAX1 检测与金标准的Kappa 值大于TCT 与金标准的Kappa 值，PAX1 检测与金标准的一致性优于TCT 与金标准，见表2。

表2 PAX1 检测、TCT 检测与病理检查结果（n）

2.2.2 两种筛查方法转诊阴道镜检率分析 267 例非16/18 型HR-HPV 患者以PAX1 检测、TCT 检测进行分流时,TCT 检测阳性转诊阴道镜检率为88.01%（235/267），PAX1 检测阳性转诊阴道镜检率为63.30%（169/267），PAX1 检测与TCT 检测比较， 阴道镜检率减少24.72%。 见表3。

表3 PAX1 检测、TCT 检测在非16/18 型HR-HPV 人群中阳性率分布

3 讨论

宫颈癌是女性常见恶性肿瘤之一， 目前国际上有多种宫颈癌筛查策略，单一筛查技术具有局限性，难免存在不足。 联合筛查可以尽量弥补各自的优缺点[12-14]，提高筛查的准确性。 HPV 检测及TCT 检测是目前临床上广泛使用的筛查方法，HPV 阳性是宫颈癌发展的必然趋势， 但大部分HPV 持续感染者最终并不会发展成宫颈癌，宫颈癌的发展是一个长期、复杂的过程，和基因及表观遗传均具有相关性[15-16]。 由于国内女性对宫颈癌认识不足，采用HPV 作为初筛手段后，阳性结果容易导致患者出现过度担忧罹患宫颈癌， 而TCT 检测由于病理医师经验不同会出现误差诊断。 甲基化作为表观遗传学方式的一种，研究显示，肿瘤细胞存在大量异常的甲基化证据，这部分宫颈癌研究中也得到证实[17]，甲基化作用强大，是肿瘤研究的热点。 基因甲基化检测用于辅助常规方式筛查[18]，对于协助宫颈癌的诊断具有一定价值。 对于非16/18 型HR-HPV 患者的追踪诊断是目前临床面临的相当耗费时间和金钱的棘手问题，故该研究在对于高危型HPV 患者进行分型初筛后， 利用PAX1 甲基化检测，对其在宫颈癌筛查中的分流价值进行分析， 可能可以对非16/18 型HR-HPV 阳性人群的追踪诊断提供新的思路。

该研究结果显示，PAX1 检测的灵敏度为92.50%，特异度为43.90%，阳性预测值为28.99%，阴性预测值为95.92%，Kappa 值为0.200；TCT 检测的灵敏度为96.20%，特异度为14.00%，阳性预测值为21.70%，阴性预测值为93.75%，Kappa 值为0.045。 两种筛查方法比较TCT 的灵敏度稍高于PAX1 检测，PAX1 检测的特异度高于TCT 检测， 且PAX1 检测与病理检查结果的一致性较TCT 检测更靠近。汤福想等[19]265 例经过宫颈癌筛查人群性PAX1 检测，发现其为检测CINII+最好的生物标志物，PAX1 甲基化的敏感性为83.0%低于HPV 检测的敏感性90.6%，但特异性87.3%较HPV 检测64.7%高，两者比较发现PAX1 甲基化可更准确识别高级别病变；杨慧红等[20]对比HPV 分型检测与TCT 检测的灵敏度分别为85.25%和76.96%，HPV 分型检测较TCT 检测有更好的灵敏度。 该研究结果显示，PAX1 检测用于非16/18 型HR-HPV 分流时，阴道镜检率降低。

综上所述，PAX1 检测可以降低非16/18 型HRHPV 患者阴道镜检率，避免过度医疗以减少患者的恐慌。