基于牙釉质基因巢式PCR性别鉴定超微量DNA检测方法的建立

唐纪伟 高庆华

聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)是一种体外扩增DNA片段的技术。自PCR技术问世以来，以其快速、准确、敏感和简便等优点在医学、微生物学和胚胎移植前遗传学诊断(PGD)等领域得到了广泛的应用［1－3］。现在，PCR技术已被广泛应用于牛、羊等动物的胚胎性别鉴定，还建立了许多基于PCR技术的家畜胚胎性别鉴定方法。随着研究的进一步深入，要求PCR性别鉴别技术在原有基础上更加快速、敏感和简捷。巢式PCR法是在PCR技术的基础上发展起来的，它是根据一个性别特异基因设计一对外引物以得到被测基因较长的扩增产物，再根据扩增产物序列设计第二对引物(内引物)对产物进行第二次扩增。巢式PCR经过两次扩增，使扩增产物的量增加，结果更容易判断，同时巢式引物的使用增加了扩增产物的特异性，提高了准确度［4］。

本实验采用巢式PCR扩增超微量山羊血液基因组DNA进行性别鉴定，旨在建立超微量DNA检测方法，在对家畜早期胚胎进行鉴定时，尽可能少的切取胚胎，以减少对胚胎的伤害，提高胚胎移植的成功率。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

2×HSTMTaq mix(广东东盛公司)、TaKaRa DL－2000 DNA marker、琼脂糖(大连宝生物公司);AB2400型PCR仪、DYCP－31BM型水平电泳槽(北京六一仪器厂)、JY－ECPT3000型稳压稳流电泳仪、凝胶成像仪;血液样品(采自阿克苏地区当地山羊)。

1.2 引物设计

根据羊AMEL基因序列，采用BLAST和Clustal W程序设计巢式引物，巢式外引物(amelF1:5'－CATGGT GCCAGCTCAGCAG －3'和 amelR1:5'－CCGCTTGGTCTTGTCTGTTGC－3')，巢式内引物(amelF2:5'－CAGCAACCAATGATGCCAGTTC－3'和amelR2:5'－GTCTTGTCTGTTGCTGGCCA －3')，两对引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.3 DNA提取、稀释及PCR扩增

1.3.1 血液基因组DNA的提取

山羊血液样品用消化缓冲液(10 mmol/L Tris－ HCl(pH 8.0)，10 mmol/L EDTA，0.15 mol/L NaCl，2%SDS)和蛋白酶 K(终浓度 0.5 mg/mL)55℃消化过夜后，加入等体积Tris饱和酚，温和颠倒混匀10 min，10000 r/min离心10 min，宽口径吸管吸取上层水相，转移至新EP管中;加入等量酚、氯仿、异戊醇(体积比25:24:1)混合液，按上述方法各抽提一次;加入2倍体积预冷的无水乙醇、1/10体积的NaAc(pH 5.2)，来回颠倒沉淀DNA;基因组DNA析出后，弃上层液体，用70%乙醇洗涤两次;留少量乙醇，自然挥发至快干时，加入灭菌三蒸水使DNA完全溶解，分装并保存于－20℃冰箱中。

1.3.2 DNA样品浓度的测定和稀释

取基因组DNA 20μL，用灭菌超纯水稀释到2000μL，以灭菌超纯水作空白对照，应用CRAY100紫外分光光度计RNA－DNA估算3.0软件包测定其浓度后，将样本梯度稀释至 10 ng/μL、1ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL。

1.3.3 PCR 反应

血液DNA巢式PCR扩增模板第一轮PCR扩增，其中 Taq mix(含 50 mmol/L KCl、20 mmol/L Tris－ HCl、3 mmol/L MgSO4、400 mmol/L dNTPs、0.1U/μLTaq DNA 聚合酶、溴酚蓝等)10μL，10 μmol/L的上下游巢式外引物各0.8μL，1μL模板(10 ng)，8.2 μL灭菌超纯水(共20 μL);预变性94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30个循环;最后72℃ 延伸5 min。第二轮PCR扩增，其中Taq mix 5μL、上下游巢式内引物引物各0.4 μmol/L，取 1μL第一次 PCR产物作模板(共10μL)，循环参数为:94℃ 5 min;94℃ 30 s，62℃30 s，72℃ 30 s，共 30个循环;最后 72℃ 延伸5 min。

超微量模板第一轮 PCR扩增，其中 Taq mix 4μL，10μmol/L的上下游巢式外引物各0.15μL，1μL模板(10 pg)，14.8 μL灭菌超纯水(共20μL);预变性 94℃ 5 min;94 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃30 s，共25个循环;最后 72℃ 延伸5 min。第二轮PCR反应其中4μL Taq mix、10μmol/L的上下游巢式内引物各0.4μL，取4.6μL第一次PCR产物作模板(共10μL)，循环参数为:94℃ 5 min;94℃30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共 40 个循环;最后72℃延伸5 min。

1.4 凝胶电泳分析

取5μL PCR扩增产物点样于1.5%的琼脂糖凝胶(含 0.05 μg/mL EB)，电压 75 V，电泳时间30 min，紫外透射仪观察扩增结果，PCR扩增产物中出现两条带者判定为雄性，出现一条带者判定为雌性，在全自动数码成像及分析系统上拍照。

2 结果

采用巢式PCR对血液基因组DNA扩增后雌性山羊只得到一条带，雄性山羊得到两条带(图1);对图1中显示经过第二次扩增后的PCR产物量远远高于只经过一轮扩增的PCR产物量，阴性对照的结果显示，从样品采集到PCR扩增的整个实验过程中没有发生DNA污染。巢式PCR的敏感性比一次PCR高100倍以上，本实验根据连续10倍梯度稀释法研究的结果，用巢式PCR法扩增10 pg量的基因组DNA仍能得到预期的阳性结果(图2)。

图2 10 pg量山羊基因组DNA AMEL基因片段巢式引物的扩增性别鉴定

3 讨论

AMEL 基因同时存在于牛［5］、羊［6］、猪［7］和人［8］中X 和Y 染色体上(AMELX，AMELY)，根据其同源区长度在两条性染色体上的不同，只需设计一对引物就能扩增出不同长度的基因片段。雌性基因组DNA的PCR产物经过电泳检验得到对应X染色体的一条非特异性条带，而雄性基因组的PCR产物可以得到两条带，分别对应X染色体的非特异性条带和 Y 染色体的特异性条带［9］。Michael等［10］的试验证明PCR鉴定可精确到单个细胞，陈从英等［11］对牛的胚胎细胞进行扩增，灵敏度可达10个细胞。本实验通过扩增山羊AMEL基因鉴定性别的方法对巢式PCR反应的敏感性进行了检测，通过连续梯度稀释法(10－2μg/μL、10－3μg/μL，10－4μg/μL，10－5μg/μL)检测的结果，可以对 10 pg量的山羊基因组DNA(约3个细胞)进行扩增。通过实验证实巢式PCR比一次PCR反应的敏感性高100倍以上［1］。由于PCR反应的高灵敏性，极易受到污染，影响鉴定结果。因此应该认真对待每一步操作，尽可能避免污染因素对鉴定结果的影响。图1的阴性对照的结果显示，实验中从样品采集到PCR扩增的整个实验过程中没有发生DNA污染。

本实验是在对胚胎进行性别鉴定之前所做的预试验。在胚胎移植前对胚胎取样进行性别鉴定时，如果从胚胎取样的细胞数少，PCR灵敏度不够，扩增产物少，鉴定结果不好判断;而如果从胚胎取样的细胞数过多，对胚胎的伤害大，影响其妊娠率。因此，在对胚胎进行切割取样时只需数个细胞就能得到准确的结果，降低了对胚胎的伤害，可以提高移植的成功率，为后期对山羊早期胚胎进行性别鉴定奠定了基础。另外，利用PCR技术还可以提高对家畜致病菌的检测［12］。

［1］ Dal Won Song，PhD Seung Jin Shin，Dong Eun Kim，et al.Detection of MAGE and SSX Gene Expressions by RT－nested PCR Using Common Primers in Head and Neck Cancer［J］.Clinical and Experimental Otorhinolaryngology，2008，1(2):97 －102.

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［12］ 顾海洋，左文斌，贺艳艳等.高致病性蓝耳病毒与低致病性蓝耳病毒RT－PCR检测方法［J］.塔里木大学学报，2011，23(1):20 －24.