中性粒细胞外诱捕网与血栓性疾病

王鑫，门剑龙（天津医科大学总医院精准医学中心，天津 300052）

中性粒细胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps，NETs）是一种由颗粒衍生蛋白修饰的DNA支架组成的胞外网状结构，包含中性粒细胞弹性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）、髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、组织蛋白酶G、乳铁蛋白、五肽释放酶3、明胶酶、蛋白酶3和肽聚糖结合蛋白等多种活性物质，而细菌、病毒、真菌、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、癌细胞、钙离子等因素可通过复杂的活化模式诱导中性粒细胞形成NETs［1］。NETs 的抗炎特性与血栓前状态密切相关，不但可通过为血小板、红细胞、细胞外囊泡和促凝血因子（如血管性血友病因子）提供支架促进血栓形成［2］，循环中NETs 组分，如无细胞DNA（cell-free DNA，cfDNA）、MPO-DNA复合物、核小体和瓜氨酸化的组蛋白等，还可激活内源性凝血途径，促进败血症、小血管炎、静脉血栓、冠状动脉粥样硬化、缺血性中风以及肿瘤相关血栓的发生和发展（其中组蛋白具有细胞毒性，可造成严重组织损伤）［3］。血浆中的NETs相关生物标志物水平在冠心病、缺血性脑卒中［4］和静脉血栓栓塞症（venous thromboembolism，VTE）［5］时发生显著改变，并与病情严重程度、临床结局显著相关。本文结合近年来NETs相关基础和临床研究文献，对NETs在血栓性疾病领域的研究进展做一综述如下。

1 NETs 的形成机制和检测方法

NETs基本特征是中性粒细胞发生剧烈形态变化的同时释放疏松的染色质、瓜氨酸化组蛋白和抗菌肽到细胞外空间并形成网络［2］，此过程称为“NETs 形成”（NETosis）［6-8］。NETosis主要有3种不同模式［6］，（1）自杀性NETosis，中性粒细胞活化后的NETs形成涉及蛋白激酶C激活、Raf-MEKERK复合物活性增加、肽酰基精氨酸脱亚胺酶（peptidylarginine deiminase，PAD）4活化以及染色质解聚，随着活性氧促使核膜消失，染色质与细胞质蛋白和颗粒介质混合，最后通过膜孔和细胞膜裂解释放到细胞外，全过程持续2～4 h；（2）非活性氧依赖的NETosis，中性粒细胞经Toll 样受体（Tolllike receptors，TLRs）和C3 补体受体刺激活化后，在5～60 min内释放NETs而不损失核膜或质膜；（3）活性氧依赖的NETosis，中性粒细胞受到C5a 或LPS 刺激的15 min 内，线粒体DNA（而非核DNA）被释放形成NETs的过程。

可视化检测NETs的方法主要包括［6-7］：电子显微镜（透射电子显微镜和扫描电子显微镜）、荧光显微镜、延时视频显微镜（活细胞成像）等。其中，电子显微镜是用于表征NETs形成特征的常用工具。但NETs的电子显微镜染色特异性低，不足以区分NETs与宿主细胞碎片或炎症部位存在的其他蛋白质。通过扫描电子显微镜（SEM）分析时，使用荧光显微镜等其他方法来验证结果是必不可少的。延时自动共聚焦成像可用于发现线粒体DNA释放形成NETs，活细胞共聚焦显微镜成像技术可以展示染色质扩展的详细时间过程。

定量检测NETs 的方法主要包括［7-8］：流式细胞术、ELISA和荧光显微镜等。利用高速多光谱成像流式细胞术可评估非线粒体DNA释放形成NETs。利用ELISA 法可定量检测人血浆中瓜氨酸化组蛋白3（citrullinated histones 3，CitH3）水平或NETs特异性MPO-DNA和NE-DNA复合物的水平。使用不同的技术、特定和标准化的评估工具通过荧光显微镜可对NETs形成进行量化，同时也是将NETosis 与其他细胞死亡机制（如凋亡或坏死）区分开的最可靠方法。

免疫组织化学法可以通过显色或荧光检测来评估蛋白质表达。通过测量血液中NETs 成分（cfDNA、组蛋白、MPO和NE）的水平或者利用cfDNA、组蛋白和NE共染色的方法可对血液和组织样本中的NETs进行检测［7］。此外，生物阻抗测量可以跟踪早期中性粒细胞激活，从而可用于监测NETosis的早期阶段，有助于刺激依赖性动力学的研究［9］。

2 NETs 与冠心病

NETs的影响贯穿动脉粥样硬化性疾病的各个阶段，与动脉粥样硬化患者血栓形成存在联系，其机制可能是诱导内皮细胞凋亡和参与斑块表面侵蚀，NETs相关生物标志物显示与动脉粥样斑块负荷、冠心病严重程度和心血管事件呈正相关［10］，故NETs 逐渐被视为参与心脑血管疾病的重要角色、生物标志物和治疗靶点。血小板、中性粒细胞与NETs间涉及复杂的相互激活，同时NETs 还可持续活化内皮细胞、巨噬细胞，进而激活凝血和补体途径。NETs形成还可通过增强血管壁炎性反应增加单核细胞募集，促进动脉粥样硬化斑块的形成和动脉血栓衍展。NETs和功能受损的内皮细胞间具有双向作用，与内皮细胞共培养的中性粒细胞会导致内皮损伤［11］，NETs中所含的基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）－9可通过激活MMP-2引发内皮功能障碍并减少主动脉内皮细胞依赖性血管舒张，而激活的内皮细胞能依赖趋化因子8 诱导NETs 形成［12］。Ramos-kichik等［11］发现，NETs 对内皮细胞的损害可被脱氧核糖核酸酶1（deoxyribonuclease 1，DNase1）消除，Josefs等［13］的研究发现，清除NETs 可以缓解糖尿病小鼠动脉粥样硬化的损害，DNase1治疗可减轻NETs 诱导的斑块－巨噬细胞炎症，促进动脉粥样硬化的消退。

2.1 NETs作为生物标志物 在急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）患者冠状动脉中的新鲜血栓栓子和正在溶解的栓子中都可见NETs，但未见于机化栓子中［14］。一项ST段抬高型心肌梗死（ST-segment elevation myocardial infarction，STEMI）患者冠状动脉血栓切除研究显示，血栓NETs负荷与梗死面积呈正相关，与ST段回落呈负相关；与来自相同患者的股动脉样本相比，经皮冠状动脉介入治疗过程中接受冠状动脉血栓切除术时从病变部位收集血浆含有更高浓度的NETs 相关生物标志物，并且病变部位的DNase1活性与血栓中NETs负荷和梗死面积呈负相关，重组DNase1能加速体外冠状动脉血栓溶解［15］。有研究显示，病变部位的中性粒细胞可通过NETosis 和随后递呈组织因子（tissue factor，TF）释放血栓形成信号［16］，NETs形成与TF血浆水平呈正相关［17］，提示血浆NETs 相关标记物水平，特别是病变部位的测定值可用于推测血栓发生的时长和严重程度，有助于临床选择治疗方案。

NETs相关蛋白已显示出诱导内皮毒性和增加血栓形成的能力，尤其是循环中NETs相关cfDNA和组蛋白在炎性作用下被NETs释放，在内皮细胞水平上加剧炎性损害，造成恶性循环。组蛋白已被证明能刺激内皮细胞Weibel-Palade小体释放血管性血友病因子（von willebrand factor，vWF）［18］，同时NETs形成的纤维蛋白样基础可为血小板黏附、活化和聚集提供支撑，进而促进vWF和纤维蛋白原蓄积以及血栓形成。亦有研究认为组蛋白和双链DNA（doublestranded DNA，dsDNA）等标志物的特异性偏低［3］。Langseth等［19］观察了dsDNA和NETs与STEMI预后的相关性（Spearman相关），结果显示，dsDNA与白细胞计数（WBC）、肌钙蛋白T（TnT）、NT-proBNP 和D－二聚体有相关性（r值分别为0.22、0.17、0.10 和0.17），MPO-DNA 与WBC 和TnT有相关性（r值分别为0.18、0.12），CitH3 与WBC 和NT-proBNP有相关性（r值分别为0.09、0.19）；NETs 相关成分水平与PCI期间植入的支架类型、糖蛋白Ⅱb／Ⅲa抑制剂或院前溶栓治疗均无相关性；在随访期间死亡的76 例患者中，dsDNA水平显著升高，并与患者的全因死亡率升高相关（P＜0.001），MPO-DNA 或CitH3 与全因死亡率无显著相关性。Riegger 等［20］多中心研究显示，NETs 与支架血栓形成的病理生理机制有关，所有支架血栓中都存在炎性细胞，25%的样本中检测到细胞外DNA 和NE 的共定位。Demyanets等［21］将外周动脉疾病患者经腹股沟下血管成形术后的CitH3和cfDNA作为NETs形成的标记物，发现循环CitH3和cfDNA可预测支架置入术后缺血结局，并与稳定外周动脉疾病的血小板活化有关。Kluge等［22］的研究显示，末端补体复合物（terminalcomplementcomplex，TCC）和C5aR1 与MPO-DNA相关，TCC 水平与稳定型冠心病患者的潜在心肌梗死风险相关。上述研究表明，NETs广泛参与动脉血管炎性损伤、凝血活化和血栓形成，在冠心病和外周动脉疾病患者的病情变化中既是生物标志物也是参与者。

2.2 NETs作为治疗靶点 NETs在AMI患者的冠状动脉血栓中非常丰富，活化血小板可通过高迁移率族蛋白B1与其附近的NETs共同参与促进冠状动脉血栓形成，NETs 更可作为血小板、红细胞和纤维蛋白的支架，以促进血栓的延伸和维持栓子稳定。NETs经常出现在形成仅数天的血栓中，但在机化程度更高的冠状动脉血栓标本中未被发现［14］。NETs结构中的核小体能通过NE降解组织因子途径抑制物（tissue factor pathway inhibitor，TFPI）来促进血栓形成，而抗组蛋白抗体治疗可较长时间阻断氯化铁动脉损伤模型中的中性粒细胞衍生核小体，其效应可在NE／组织蛋白酶G 双敲除小鼠中完全逆转［23］。在小鼠心肌缺血／再灌注损伤模型中，通过注射DNase1靶向阻滞NETs形成过程，可降低损伤部位核小体和CitH3的血浆水平并显示出对心脏保护的特性［24］。Ge等［25］的研究显示，DNase1 联合重组的组织型纤溶酶原激活物（rt-PA）治疗可减少大鼠心肌缺血性损伤模型的梗死面积和无血流面积，减轻缺血后左心室重塑，而这些有益效果在单独使用DNase1或rt-PA治疗的大鼠中尚未观察到。此外，DNase1也显示出促进溶血磷脂酸（Lysophosphatidic acid，LPA）诱导NETs产生溶解栓子效应［26］，上述研究表明抗NETs形成药物可通过抗组蛋白、DNase1单独或联合应用等多种模式阻断NETs对动脉血管的炎性损害过程，对缺血性心脏病产生治疗效果。

3 NETs 与缺血性卒中

NETs在脑卒中患者高凝状态中起着关键作用。Kang等［27］的研究显示，中风导致中性粒细胞在大脑血管募集，进而干扰中风后血管重塑。脑卒中后清除NETs 可促进血管重建，而NETs形成过量或NETs 清除不力对卒中后的血管重建和血管修复产生负面影响。因此，NETs 既是反映卒中风险的生物标志物，也是促进脑卒中患者新生血管形成和功能恢复的关键靶点。

3.1 NETs作为生物标志物 核小体、dsDNA和CitH3的血浆水平与缺血性中风患者的卒中严重程度和预后相关。Vallés等［4］发现，急性缺血性卒中（acute ischemic stroke，AIS）患者的核小体、dsDNA 和CitH3 水平显著高于健康人群，其中特异性较高的CitH3增幅最大，这些NETs标记物的水平与患者入院时的卒中严重程度相关（基于NIHSS 量表评分和修正Rankins量表评分）；血中CitH3 和dsDNA 水平在心源性卒中患者更高，其原因可能与炎症高反应相关；在空腹血糖较高的老年患者和既往房颤患者中，CitH3升高且与1年随访期内的全因死亡率有独立相关性。这些结果表明CitH3可能是评估AIS 预后的潜在标志物。在脑缺血过程中，在毛细血管内部和周围形成NETs 会促进血栓形成，Laridan等［28］的研究显示，与新鲜血栓相比，陈旧性血栓富含CitH3和NE；Perez-de-puig等［29］发现，从缺血性中风患者脑循环中提取的血栓存在DNA 和CitH3 的支架结构，推测NETs可能促进继发性微血栓，而这种继发性血栓形成可导致缺血时间的进一步延长，并使溶栓时间窗变窄。与非心源性血栓相比，心源性脑卒中血栓中NETs 含量更为丰富，在所有栓子中都存在大量NETs，陈旧性血栓中的NETs 比新鲜血栓的含量更高，表现为dsDNA、MPO和瓜氨酸化组蛋白4的三联共染色阳性，而且血栓切除术耗时和器械通过次数与NETs 表达水平呈正相关［30］。Lim 等［31］的研究显示，急性冠状动脉综合征（acute coronary syndrome，ACS）组和AIS组dsDNA浓度均高于对照组（P＜0.001），在单变量和多元分析中，ACS组的肌钙蛋白I（TnI）、dsDNA（P值分别为0.046和0.015）和AIS 组的dsDNA 浓度增高（P＝0.002）有统计学意义；在ROC分析中，ACS组TnI和dsDNA的曲线下面积分别为0.878 和0.968，AIS 组的dsDNA 为0.859；研究认为，在ACS和AIS患者中，外周循环中的NETs 水平在最初发病时增加，可作为早期诊断的生物标志物。目前，基于对血栓栓子的共定位染色和血浆浓度研究，缺血性卒中时NETs组分高度表达，初步认为dsDNA和CitH3、CitH3和NE以及dsDNA、MPO和瓜氨酸化组蛋白4 可能是评估血管损伤严重程度、病情发展和临床预后的潜在生物标志物。

3.2 NETs 作为治疗靶点 Zhou 等［32］的研究显示，在颈动脉血栓形成局部有富含磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）的NETs、血小板和血小板衍生微粒的蓄积，激活的血小板与NETs和PS起互补作用，含PS的NETs为血小板衍生微粒和凝血因子沉积提供平台，从而增加凝血酶和纤维蛋白形成，NETs相关蛋白酶和组蛋白通过诱导PS 暴露和TF表达，对内皮细胞产生强烈细胞毒性作用并增强受损内皮细胞的促血栓能力；DNase1 和PS 抑制剂明显拮抗上述作用。Peña-Martínez等［33］针对溶栓治疗时“t-PA 抵抗现象”的研究显示，注射DNase1 可促进NETs 溶解（非t-PA 所致溶解），使闭塞血管再通，改善光凝性卒中的预后；用氯酰胺预防性治疗可阻止NETs 形成，避免血栓闭塞。由于NETs在颈动脉病变部位造成的损伤与多种因素有关，并可能通过阻止NETs形成的方法进行治疗，预期将有更多相关研究聚焦于抑制NETs形成的方法以降低NETs形成带来的负面影响。

4 NETs 与静脉血栓

循环中的NETs 相关生物标志物水平与静脉血栓性疾病的严重程度相关，但NETs并不是这些生物标志物的唯一来源，目前尚不清楚是否能反映这些患者中的NETs形成。

4.1 NETs促进VTE的机制 NETs的关键成分在静脉血管内产生促凝作用。在静脉血栓形成时，中性粒细胞主要通过vWF、TF和黏附分子介导途径在活化的内皮细胞表面募集，构成了疾病早期阶段血栓结构中炎性细胞的大部分。Brill等［34］的研究显示，组蛋白输注导致vWF 释放，并在下腔静脉狭窄模型中发现可加速深静脉血栓形成（deep venous thrombosis，DVT）；来自大鼠下腔静脉狭窄模型显示，血栓结构主要以vWF 相关的NETs 存在为特征，尤其是在早期，NETs通过组蛋白A1结构域与vWF产生相互作用，同时也结合其他与血栓形成相关的蛋白，如纤维连接蛋白（含有能与DNA结合的结构域）［35］。此外，TF在静脉血栓形成中与NETs关系密切，在NETs生成过程中，中性粒细胞同时产生TF和NE以增加TF活性（NE在TFPI的裂解过程中至关重要），当血小板和中性粒细胞被促凝因子激活后，中性粒细胞产生的NETs成为捕捉血栓基本成分（如红细胞、白细胞、血小板和激活的凝血因子）的网络和框架。

Li等［26］研究显示，在急性肺动脉栓塞患者中，NETs 和LPA显著升高，LPA通过PAD4依赖性途径诱导NETs的快速释放，并诱导NETs 产生有抗t-PA 特性的血栓。同时，LPA诱导的NETs可以激活血小板释放LPA，从而产生正反馈机制（LPA信号诱导NETs释放），因此LPA-NETs信号通路可能是VTE防治的新靶点。

Savchenko等［36］研究发现，来源于手术或尸检组织样本的免疫组化分析显示，NETs主要存在于VTE正在机化的区域，而在完全机化的血栓局部则很少出现NETs；表明随着中性粒细胞进入血栓，NETs形成可能是短暂的，并且随着血栓逐渐机化，细胞外NETs开始降解并被胶原网络所取代。由于NETs可以刺激纤维化重塑并促进血栓稳定，而这种血栓很难被内源性纤溶系统降解，故与VTE 的后遗症密切相关（如血栓后综合征或慢性血栓栓塞性肺动脉高压）。

4.2 NETs作为VTE标志物 有研究显示［34］，与野生型小鼠相比，PAD4 -／-小鼠进一步证实了NETs 形成在静脉血栓形成中的作用，NETs缺乏导致下腔静脉狭窄后血栓减少，补充DNase1也显示出类似的效果。van Montfoort 等［37］发现，DVT患者循环血液中核小体和弹性蛋白酶－α1－抗胰蛋白酶复合物的水平高于非DVT 患者；Diaz 等［38］研究显示，DVT患者血浆高DNA浓度与D－二聚体、Wells评分和MPO有相关性。

4.3 活动性肿瘤相关VTE 肿瘤细胞、肿瘤诱导活化的血小板、肿瘤或宿主分泌的细胞因子（如粒细胞集落刺激因子和白细胞介素－8）［39］均可对中性粒细胞产生促NETs 形成的效应。

NETs可诱导血小板活化，活化的血小板可通过造血调控和诱导免疫细胞向肿瘤部位迁移，形成肿瘤相关炎性微环境，进而增加DVT风险。血小板TLR4可以触发NETs形成，血小板P－选择素也可通过其糖蛋白配体－1激活中性粒细胞形成NETs［40］，而中性粒细胞在该过程中释放的组蛋白3和4 可依次激活循环中的血小板，NETs 中的cfDNA 不但能直接激活血小板，还可激活凝血因子Ⅻ，放大凝血效应，促进纤维蛋白沉积，为血栓形成提供了强刺激和支架结构。近年研究发现，肿瘤相关细胞外囊泡与中性粒细胞共孵育可促进NETs形成，并可黏附于NETs 复合物［41］，表明肿瘤相关细胞外囊泡与中性粒细胞之间的相互作用可能是增加肿瘤相关血栓风险的重要原因。

肿瘤细胞可直接诱导NETs的形成，在转移过程中借助NETs保护其免受循环血流剪切应力和免疫系统的影响，进而促进肿瘤生长、血管生成和转移［42］。中性粒细胞在形成NETs的同时，还促进细胞因子分泌，提供各种与肿瘤发展相关的物质，其中NE可刺激肿瘤生长和传播［43］，白细胞介素－8直接刺激血管生成［44］，同时来自于细胞外基质的VEGF 可通过MMP-9对血管生成产生正反馈效应［3］。Hisada 等［45］证实，注射DNase1 显著降低肿瘤小鼠的血栓重量，但不影响对照小鼠的血栓重量；Leal 等［41］发现，DNase1 应用于肿瘤小鼠和对照小鼠可完全消除动脉血栓形成，并降低肿瘤小鼠的VTE负荷，但不影响对照小鼠的静脉血栓形成。大量研究表明，NETs与TF、vWF 和纤维蛋白结合形成的网络为癌细胞转移扩散提供支架结构，DNase1可阻滞此过程，从而为肿瘤相关VTE的防治提供新的靶点和治疗思路。

5 展望

在检测领域，由于NETs 异质性强，其表达受多种病理生理因素的影响，使得现阶段的检测方法都存在局限性（尤其是特异性），因此基于免疫组化技术、流式技术、化学发光技术、免疫荧光技术开发多种类型的生物标志物，并围绕疾病发展、器官损伤以及血栓相关终点事件进行队列研究，筛选具有针对性的NETs检测指标，将有助于临床从表观遗传学视角更为准确审视血栓发生发展的病理机制，为临床干预提供依据。

在治疗领域，目前研究显示，除DNase1、乙酰半胱氨酸、维生素D和氯喹外，靶向B细胞药物（利妥昔单抗）、补体系统和潜在IFN-α的单克隆抗体均可能抑制NETs形成过程，因此靶向预防NETs 形成可能在未来成为防治血栓的新方法。但需注意的是，抑制NETs形成有可能会影响机体对细菌的捕获、杀灭和清除能力。此外，NETs 被破坏之后，其成分（citH3、MPO）扩散到循环中亦有可能加剧全身炎症反应。因此尚需进行更多的观察试验，评估针对NETs及其下游级联反应采取干预措施的安全性和有效性。