多形核中性粒细胞在脑出血继发性损伤中的研究进展

王从凯，张 鑫综述，李爱民审校

0 引 言

脑出血(intracerebral hemorrhage，ICH)是致死率最高的卒中亚型，占急性脑血管病的20%～30%[1]。尽管ICH的病理生理被广泛研究，但尚无临床认可的神经保护治疗方法。目前越来越多证据表明炎症反应是继发性损伤中的核心部分[2-4]。中枢神经系统受损最终必然引起炎症免疫反应，而多形核中性粒细胞(polymorphonuclear neutrophils, PMNs)最早到达ICH部位，是发挥主要作用的外周免疫细胞[5-6]。一方面通过吞噬血肿降解异物发挥有益作用，另一方面PMNs到达出血部位并浸润脑实质，释放大量的炎性细胞因子，激活其他细胞炎性细胞，通过破坏血管基质，损伤神经元及破坏血脑屏障(blood brain barrier，BBB)完整性从而引起继发性脑损伤[7]。PMNs新的杀菌机制-中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps，NETs)在中枢神经系统中的抗炎作用亦被广泛研究[8]。近来研究显示ICH患者外周PMNs计数升高和中性粒细胞/淋巴细胞比值(neutrophil-to-lymphocyte ratio，NLR)升高是患者预后不良的独立危险因素，同样表示PMNs在ICH发生、发展过程中扮演重要角色[9]。本文就PMNs在ICH继发性损伤中的作用及相关最新研究进展作一综述。

1 PMNs与ICH继发性损伤

1.1 中枢神经系统中的PMNsPMNs亦可简称中性粒细胞，是人体免疫系统中含量最丰富的白细胞[10]。PMNs来自骨髓中的粒细胞-单核细胞祖细胞。一般需要14 d的生长周期，PMNs成熟，增殖，分化并发育出其特征性颗粒[11-12]。正常情况下由于存在脑血屏障，极少存在于脑实质和脑脊液中[13]。脑内皮细胞之间的紧密连接可确保屏障完整性和高选择性。然而，在感染，创伤，局部缺血和出血等病理状况下，PMNs进入脑组织的数量增加[14-16]。在被招募的炎症细胞中，PMNs被认为首先到达血肿区域发挥固有免疫应答作用。目前实验表明，小鼠PMNs的平均寿命可达12.5 h，而人类PMNs的平均循环寿命可达5.4 h[17]。在炎症反应过程中，由于炎性因子或者细菌产物的作用，PMNs的生存期可相对延长。Zhao等[15]对ICH 大鼠模型研究发现PMNs 在ICH后 24～48 h 达到高峰，3 d时数量下降，14 d时仍可见少量表达。

PMNs的分化和成熟与其功能紧密相关。其分化成熟受到内源性因素例如粒细胞集落刺激因子(granulocyte-colony stimulating factor，G-CSF)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage-colony stimulating factor，GM-CSF)或外部刺激(创伤，药物和辐射等)调节。随着分化和成熟，PMNs膜蛋白的表达水平发生变化，对于感知感染信号，迁移到目标组织以及吞噬细胞组织碎片很重要。在成熟和活化的PMNs中，整联蛋白β1和趋化因子受体4(C-X-C chemokine receptor 4，CXCR4)被下调，而CXCR2，Toll样受体4，甲酰肽受体(N-formyl peptide receptor，FPR)，CD11b和CD35被上调。除膜受体外，各种颗粒蛋白的表达水平也发生重大变化。颗粒蛋白一般分为三种：初级颗粒包括髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)，中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase，NE)和组织蛋白酶G；次要颗粒包括Lysozyme和乳铁蛋白(lactoferrin，LF)；三级颗粒包括基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)[18-19]。除脱粒和吞噬作用外，积聚的粒细胞还可释放由DNA和称为嗜中性粒细胞外陷阱的蛋白质组成的细胞外网状结构，其会损害血脑屏障，并造成周围神经元和大脑其他细胞的后续伤害[8]。目前NETs在缺血性卒、神经退行性病变及中枢神经系统感染性疾病中已被广泛研究，而对于在ICH中具体的作用目前研究较少仍需进一步探索。

1.2PMNs对血脑屏障的破坏血脑屏障是一种由特殊分化的微血管内皮细胞、周皮细胞和星形胶质细胞终足组成紧密连接的高度选择性生物屏障[20]。ICH时，血液从破裂的血管进入脑实质及其间隙，导致原发性脑损伤。除血管破入脑组织的PMNs，PMNs通过聚集、滚动、黏附、爬行和迁移至受损区域，实验证实在ICH核心区域和血肿边缘发现了大量的脑实质内中性粒细胞(与血管无明显关联)[15]；通过释放的一系列因子包括活性氧(reactive oxygen species，ROS)、MMP、NE及细胞因子等破坏BBB，进一步加重脑损伤[7,21]。中性粒细胞来源的MMP在ICH后血脑屏障的损伤中发挥重要作用，包括MMP-2、MMP-3和MMP-9[22]。MMP在卒中后24 h内可被白细胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)明显诱导，并使神经血管单位的结构发生退化。活化的MMP-9通过降解细胞外基质的层粘连蛋白、胶原酶及紧密连接蛋白参与损害血脑屏障。研究表明，在用抗多形核白细胞抗体(anti-PMNs)消耗了循环血液PMNs后，MMP-9产生减少，继发性BBB破坏以及轴索损伤均减轻，从而减轻了大鼠ICH后继发性脑损伤[14]。NE是极具破坏性的蛋白水解酶，一旦释放进入相关的受损脑组织，NE 就可降解基底膜和细胞外基质及其他蛋白成分；从而损伤血管，增加血管通透性，加重血脑屏障损伤，进一步造成脑水肿[23]。激活的PMNs也是ROS、一氧化二氮(nitrous oxide，NOS)等自由基的关键来源。ROS通过诱导直接氧化损伤内皮细胞、周细胞、平滑肌细胞和卫星细胞作用于神经血管单位，导致BBB通透性增加[24]。显然，中性粒细胞对血脑屏障的分解有助于招募更多的免疫细胞来清除细胞碎片，但同时也导致了脑内继发的损伤。

1.3PMNs加重脑水肿ICH后的脑水肿是ICH后继发性损伤的关键因素，其引起的颅内压升高和低灌注压增加了脑疝、脑梗塞发生的风险[25-26]。ICH后脑水肿有三种主要类型[27]：血管源性水肿，细胞毒性水肿和混合性水肿。血管源性水肿归因于血脑屏障的破坏，损伤的血脑屏障使血管内的蛋白质和液体渗入实质细胞外空间；细胞毒性水肿是由于脑缺血、缺氧，能量ATP供应不足，致使离子泵的功能衰竭，细胞中异常水潴留的结果；渗透性水肿是由血液和组织之间的渗透性失衡引起的[28-29]。PMNs和ICH后脑水肿紧密相连，一些研究表明PMNs的耗竭显着降低了脑组织水肿。由于血管源性水肿与血脑屏障的血管完整性紧密相关，PMNs与血脑屏障之间的相互作用也可能影响血管源性水肿。PMNs通过和内皮细胞之间的异常相互作用参与了血脑屏障的分解。除受损伤的组织或PMNs释放的趋化因子、弹性蛋白酶和活性氧以外，其他的各种介质诸如谷氨酸，乳酸，H+，K+，Ca2+，组胺和激肽亦可增强血管源性和细胞毒性水肿，还可促进广泛的PMNs浸润和神经星形胶质细胞损失[30]。细胞毒性水肿通常伴随细胞内Na+和其他阳离子的积。Na+/H+离子泵在脑组织细胞毒性水肿中发挥重要作用[31-32]。有研究表明，在小鼠实验中性胞内钠浓度的改变对于活化的PMNs趋化功能有密切影响[33]。O'Donnell等[34]表明用Na+/H+交换抑制剂HOE-642抑制Na+/H+转运蛋白可显着减轻缺血模型中的脑梗死体积，减轻脑水肿和PMNs积累。因此，除传统的细胞因子外，受损脑组织中的酸度和阳离子都可调节PMNs的活化和细胞毒性水肿。

1.4PMNs与血肿扩大血肿扩大(hematoma expansion，HE)一般发生在初次出血后的6 h内，是早期神经功能恶化和长期不良功能预后的有力预测指标[35]。白细胞与血小板，血管内皮和凝血因子相互作用，被认为是在生理和病理条件下促进止血的重要因素[36]。活化的PMNs表现出显着的促凝特性，因此可能在ICH发生后止血中起重要作用[37]。首先，PMNs释放组织因子(tissue factor，TF)并下调TF途径抑制剂，有利于血栓形成；其次，PMNs可激活血小板，X因子和XII因子，增强凝血酶的生成，并有助于纤维蛋白凝块的稳定[38-39]。PMNs在ICH超急性期的激活可能通过促进凝血系统而限制血肿扩大。Chen等[40]对2546例ICH患者行回顾性分析，研究结果显示入院时白细胞，PMNs和单核细胞的外周计数与早期血肿扩大的风险独立相关；ICH后白细胞及PMNs升高降低血肿扩大风险，单核细胞升高增加血肿扩大风险。然而PMNs释放的NE、MPO及组织蛋白酶等可诱导神经元及胶质细胞凋亡和损伤血管结构。损伤的小动脉可能继发出血并形成血肿扩大征象。有ICH模型证实PMNs于ICH后1-3 d在血肿周围浸润达到高峰，但血肿周围血管结构在 ICH 发生后逐渐出现进行减少[15]。对于PMNs与血肿扩大的关系似乎患者回顾性分析结果与动物实验结果有矛盾之处，表明两者之间关系复杂，需要更加深入探究。

2 PMNs的表型转换和神经保护作用

最近越来越多的证据表明，与其他免疫细胞一样，PMNs可能表现出一定程度的功能可塑性，类似于Th1型/Th2型(T细胞)、M1/M2(小胶质细胞)[41-43]。N1 PMNs表型是指具有更强的促炎/氧化特性的PMNs，胞内主要表达 MPO、NE 等杀伤细菌及抗原成分，具有有效的抗肿瘤和抗微生物作用，可能对卒中患者的大脑造成更大的有害影响。假设大多数循环中的PMNs通常处于N1状态，为最大限度地提高其有效参与抗菌活动的能力，卒中后早期进入大脑的PMNs可能主要是有害的。相反，N2 PMNs表型的特征是促炎特性降低，胞内含有丰富的LF和结合珠蛋白等对组织修复有益成分。因此，有学者提出PNMs对卒中结局的影响可能取决于N1/N2比率，该比率可能在卒中后随时间改变，从而减少PMNs浸润的有害影响，甚至潜在地赋予受损组织好处。Zhao等[44]表明脑内出血后脑脊液和血液中的免疫调节细胞因子IL-27被上调；发现IL-27可改变骨髓中PMNs的成熟，抑制其促炎和细胞毒性信号的产生，同时增加其有益的铁清除分子(如乳铁蛋白)的产生。重要的是，IL-27或乳铁蛋白减少了脑水肿，增加了血肿清除率，并改善了ICH后的神经功能。这些结果表明IL-27/乳铁蛋白介导的嗜PMNs功能调节可能代表了免疫治疗的目标。此外，过氧化物酶体增殖剂激活受体-γ(pperoxisomeproliferators-activated receptor，PPARγ)激活促进了巨噬细胞Mφ向愈合(M2)表型的转化。Cuartero等[45]最近发现，患有脑缺血并接受PPARγ激动剂罗格列酮治疗的小鼠，显示N2(Ym1)表型比例增加并且梗死面积减少。近期一项研究确定了PMNs未成熟N2亚型，该N2型PMNs可渗入小鼠中枢神经系统损伤的部位，并部分地通过分泌各种生长因子来促进神经损伤的保护和再生。

3 PMNs在卒中预后预测中的价值

PMNs及其相关的炎症指标逐渐被发现在卒中预后预测中的具有重要价值。证据表明外周血白细胞及PMNs水平对于卒中后神经系统恶化和预后具有预测价值。Tao等[46]回顾性纳入336例发病24h内的ICH患者，通过多因素分析显示，较高的PMNs计数及NLR与死亡率和不良的预后独立相关，并且与单纯PMNs计数相比NLR表现出较高的预测能力。NLR整合白细胞的两种亚型，被认为是稳定有效的炎症标志物，可综合反映免疫炎症状态[47]。目前大量研究提及表明，NLR对于ICH后血肿周围水肿体积增大、神经功能恶化和不良预后都有良好的预测价值[9,48-49]。这种预测作用在调整其他风险因素(年龄，性别，基线血肿量脑室扩大出血，格拉斯哥昏迷量表评分，卒中后发作的时间)以后仍然存在。而其他的PMNs相关炎症标志物，如中性粒细胞比白蛋白比值(neutrophil-to-albumin ratio，NAR)，目前证明在肿瘤及重症感染预后、颈动脉狭窄术再狭窄等方面均有较好的预测价值[50-52]；在出血性脑卒中方面，最新研究证明，NAR与动脉瘤性蛛网膜下腔出血(aneurysmal subarachnoid hemorrhage，aSAH)患者入院时神经功能分级相关，并且NAR水平的升高是aSAH患者发生迟发性脑缺血的独立危险因素[53]。因此，中性粒细胞与白蛋白比值在在ICH预后中的价值值得我们进一步探究。

4 结 语

ICH继发性损伤是一个复杂的过程，炎性细胞在此过程中起重要作用。PMNs作为最早被研究的免疫细胞之一，其详细功能仍然不清楚。大量的实验研究证据表明PMNs在脑卒中中具有根本的，主要是有害的作用。PMNs会部分加剧血脑屏障的破坏、脑组织水肿和继发性血肿扩大，从而影响神经功能的预后。最近的研究还指出了具有神经保护特性的抗炎型N2 PMNs的存在。未来的研究应更彻底地表征PMNs的作用，旨在确定PMNs在ICH后炎症反应的治疗靶点，选择性消除PMNs的有害作用，同时保持其在ICH中的有益作用。但是，针对PMNs的干预措施应谨慎评估，因为PMNs的生理功能对于卒中患者的免疫防御至关重要。