硒纳米颗粒抗菌作用及机制的研究进展

李雨清综述，张 博，赵潇雄审校

0 引 言

据相关文献报道，我国某医院1年内院内感染死亡患者占总死亡患者11.5%，死亡患者的院内感染率明显高于其他住院患者，可见院内感染是危及住院患者生命的重要因素之一[1]。近年来，由于抗生素的不合理使用，耐药细菌感染成为导致院内感染的重要因素[2]。目前常见的多重耐药性(multidrug resistance，MDR)细菌有耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantS.aureus，MRSA)、耐万古霉素的MRSA、多重耐药的铜绿假单胞菌、耐碳青霉烯类的鲍曼不动杆菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯杆菌、耐万古霉素的肠球菌、广泛耐药的结核分枝杆菌等[3]，其中院内感染最常见的是耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌。纳米颗粒作为治疗剂的应用越来越得到重视，其优势主要在于较小的尺寸和较高的表面质量比，从而实现与生物系统更有效的相互作用[4]。硒是人体中不可缺少的微量元素，在人体内，硒以硒蛋白的形式存在。硒蛋白在抗氧化、抗菌、抗炎、调节自身免疫、改善甲状腺疾病等方面具有重要作用[5-7]。众多实验表明，硒纳米颗粒(selenium nanoparticles，SeNP)在抗菌方面显示出良好优势，但SeNP在抗菌方面的作用机制还不十分明确。本篇综述介绍了硒纳米颗粒的制备方法、抗菌作用、抗菌机制、生物相容性和临床应用。

1 硒纳米颗粒的前期制备及其抗菌作用

硒纳米颗粒前期制备的方法多样，有物理、化学、生物等多种方式。殊途同归，这些硒纳米颗粒都具有良好的抗菌作用。Geoffrion等[8]学者使用液体脉冲激光烧浊法(pulsed laser ablation in liquids，PLAL)的物理方法生产纯裸SeNP，经过两轮辐照将颗粒尺寸缩小到100 nm以下，这种方法具有尺寸稳定、环保高效、性价比高的优点。对所得的硒纳米颗粒进行抗菌能力测定，实验发现：与对照组相比，SeNP可以降低表皮葡萄球菌、耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)、铜绿假单胞菌、多重耐药的大肠埃希菌的存活数量，且SeNP浓度越高，细菌存活数越少[8]。

最近，有学者提出一种可控纳米颗粒尺寸的新型化学合成法[9]：利用亚硒酸钠、抗坏血酸和牛血清白蛋白一步反应合成牛血清白蛋白包裹的SeNP；产物的直径大小与搅拌速度、反应物与还原剂之比有关；此法不需使用刺激性溶剂或碱，更加安全环保。其抗菌效果也令人满意：在100 r/min，1∶6时，0.1、1 mg/mL的SeNP对金黄色葡萄球菌的抑制率可分别达到74%、91%[9]。

利用植物、细菌等生物体合成SeNPs具有取材便捷、环境友好的优势。由Providencia sp.DCX(一种藻类)合成的SeNP对革兰阳性菌和革兰阴性菌都表现出强大的抑制活性，用500 mg/L SeNPs处理时，大多数测试细菌会在12 h内被破坏，其中革兰阴性菌的死亡率更高[10]。采用植物乳杆菌LP21合成的SeNP对溶藻弧菌、大肠埃希菌抑菌活性较强，其中，对溶藻弧菌的最低抑菌浓度(MIC)为286 μg/mL[11]。利用革兰阴性嗜麦芽孢杆菌和革兰阳性芽孢杆菌合成的SeNP也具有良好的抗菌作用[12]。无论是单独使用，还是与传统抗生素结合使用，SeNP都可以抑制铜绿假单胞菌的生长，或促进抗菌剂对铜绿假单胞菌和念珠菌生物膜的渗透[12]。

仿生多功能抗菌纳米系统(Ru-Se @ GNP-RBCM)是将Ru复合体与SeNPs装入明胶纳米颗粒(gelatin nanoparticles，GNPs)中，并在其表面覆上红细胞膜(red blood cell membrane，RBCM)构建而成的。体外实验中，由于红细胞膜包裹，Ru-Se @ GNP-RBCM可以逃避巨噬细胞的吞噬作用，提高药物利用率，有效降低MRSA分泌的外毒素的溶血活性，并释放Ru-Se NP破坏细菌的细胞结构。体内感染MRSA的小鼠模型也证明了纳米系统具有促进细菌感染伤口愈合的能力[13]。另有研究发现，对于不同的微生物物种甚至同一物种的不同菌株来说，SeNP的最小抑菌浓度(minimal inhibit concentration，MIC)差别很大，范围从4 μg/mL到128 μg/mL不等。其研究结果大致符合：革兰阳性菌(如金黄色葡萄球菌)对SeNP较敏感，其MIC比革兰阴性菌低[14]，但具体原因还有待进一步探究。

2 抗菌机制

2.1 硒纳米颗粒抑制生物膜形成生物膜是附着在生物材料表面的微生物群落，在持久的细菌感染中起重要作用。微生物有两种不同的生命形式：浮游形式和生物膜形式[15]。当人体免疫防御功能下降时，机会致病性病原体就会在植入物表面黏附、定植，继而形成生物膜[16]。生物膜可以充当机械屏障，阻碍抗菌剂和免疫反应效应器的渗透[12]。与浮游形式相比，生物膜形式中的细菌对于抗生素的抵抗力要高出几个数量级[17]。

Tran等[18]分别在体内外对SeNP的抗菌性能进行了测试。体外实验表明：SeNP可以抑制MRSA、MRSE的生长，而对原代成骨细胞的生长无明显影响。在大鼠体内的实验结果表明：未涂覆SeNP的植入物周围组织抽取的菌落总数高于从涂覆SeNP的植入物周围的组织中获取的菌落总数量(P=0.03)；涂层板上生物膜最大厚度约为3 μm，而未涂层板上的生物膜最大厚度为5～16 μm。SeNP在体内外均有良好的抑制MRSA和MRSE生长的作用。

Cihalova等[19]通过测量相对阻抗，来测量细菌生物膜厚度，阻抗越高，生物膜越厚。实验结果表明，与对照组相比，单独使用SeNP或抗生素后，金黄色葡萄球菌的相对阻抗值均明显降低，生物膜破坏率在70%以上；当SeNP和抗生素联合使用时，生物膜破坏率达到90%以上。与普通金黄色葡萄球菌相比，MRSA对于SeNP和抗生素的抵抗力更强，SeNP对MRSA生物膜破坏率仅有(55±3)%，抗生素对MRSA生物膜破坏率小于20%；但当使用SeNP和抗生素的复合物时，由于协同作用，其生物膜破坏率可达80%。从两种细菌的实验结果来看，SeNP与抗生素的联合使用，可以抑制生物膜的形成。运用质谱法对上述各组细菌进行蛋白质测定，结果发现与对照组相比，在生物膜受抑制的实验组中，几乎所有蛋白质的表达均受到抑制，从而推测SeNP和抗生素的联合使用抑制了细菌蛋白质的表达，来影响细菌的结构与功能。SeNP可以抑制生物膜形成[20]，使细菌在组织内以浮游形式存在。抗生素与SeNP的联合使用，可以增加细菌对抗生素的敏感性，以利于抗生素发挥杀菌作用。

2.2硒纳米颗粒下调细菌相关蛋白的表达外膜蛋白A(OmpA)是革兰阴性菌外膜蛋白的主要成分，在维持细菌表面完整性、介导细菌生物膜形成、真核细胞感染、抗生素抗性和免疫调节等方面发挥作用[21]。OmpF孔蛋白通道保护细菌免受有害溶质渗透，但可以使小的亲水性溶质穿过细菌外膜[22]，OmpF孔蛋白的失活可以降低细菌的黏附、侵袭、定植、增殖能力[23]。大肠埃希菌在涂有SeNP的二氧化钛纳米管中培养24 h后，ompA、ompF基因的表达下调，表明暴露于SeNPs的大肠埃希菌可能因为膜功能减弱，而导致细胞死亡[24]。

Curli是大肠埃希菌外薄而卷曲的蛋白质纤维，与生物膜形成、宿主细胞黏附以及惰性表面定植有关。Curli的合成受两个操纵子csgBAC和csgDEFG的控制。csgBAC操纵子编码curli的结构亚基CsgA和CsgB，以及伴侣蛋白样蛋白CsgC。csgDEFG操纵子编码有效转录，分泌和组装Curli纤维所需的辅助蛋白[25-26]。CsgA是Curli主要的纤维亚基，CsgG和CsgF是2个外膜定位组件，用于分泌和组装CsgB和CsgA[27]。在中、低浓度的SeNP会使大肠埃希菌的csgA和csgG基因表达略有上调，在高浓度SeNP的样品上，两种基因的表达被进一步下调。表明随着SeNPs浓度的增加，大肠埃希菌Curli蛋白的表达受到抑制，从而降低了大肠埃希菌的黏附性[24]。

2.3硒纳米颗粒直接破坏细菌细胞膜与常规的微粒相比，纳米颗粒的表面积增加，与细菌之间的相互作用增加；另外，纳米颗粒比微米颗粒更有可能进入细胞，从而可能对细菌产生更强的作用[24]。在一项实验中，与不添加SeNP的对照组相比，当SeNP与细菌溶液混合时，3 h后，细菌生长被抑制了约20倍，4 h后被抑制了50倍，5 h后被抑制了60倍[28]。

Zhang等[10]发现，细菌与SeNP共培养后，泄漏在外的蛋白质和多糖明显增多，这提示细胞膜通透性改变、细胞壁遭到破坏；最终，这一推论在扫描电子显微镜下得到证实：革兰阴性菌和枯草芽孢杆菌(G+)大部分细胞膜被SeNP覆盖，并且膜表面显示出明显凹坑和间隙；金黄色葡萄球菌细胞膜起皱、变平、出现漏孔。

MRSA是明胶酶阳性的革兰阳性菌，大肠埃希菌是明胶酶阴性的革兰阴性菌。将MRSA、大肠埃希菌分别与Ru-Se @ GNP-RBCM共同培养后，电镜扫描结果显示：MRSA的细胞壁明显收缩，破裂严重，细菌的球形形态发生明显变化，有内容漏出；而大肠埃希菌仅有轻微的变形和破裂，其表面黏附有纳米颗粒。经过其他的实验对照研究，推测与以下三方面有关：①MRSA可以分泌明胶酶，降解GNPs，从而释放Ru-SeNP；②由于MRSA(革兰阳性菌)没有脂多糖等结构保护，纳米系统可以对这种相对简单的细胞壁造成破坏；③纳米系统穿过细胞壁后，与细胞膜相互作用，膜结构被大量破坏，从而导致细菌裂解和内容物泄露，造成细菌死亡[13]。

2.4硒纳米颗粒激活释放细菌活性氧活性氧是具有高度反应性的含氧物质[8]，具有直接抗菌作用，可以通过与酶、蛋白质、DNA以及细菌细胞膜中的硫醇基反应等多种途径来发挥抗菌作用[29]。加入SeNP的二氧化钛纳米管可以抑制大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的生长[24]。在该体系中，随着SeNP数量的增加，细菌产生活性氧的水平升高，同时抑菌效果也逐渐增强。在电镜下，可以观察到细菌膜上有大量裂纹，细菌变形塌陷[8]，提示活性氧可能通过膜脂质过氧化作用，导致细菌膜孔隙率增加[24]。Cremonini等[14]的实验发现，与对照组相比，加入SeNP后，铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、洋葱伯克霍尔德菌中活性氧水平均明显上调。氢过氧化物酶I由大肠埃希菌ahpF基因编码，可以将活性氧转化为相应的醇以减轻细胞氧化应激[30]。在氧化应激状态时，ahpF常常会过表达[31]。与对照组相比，加入不同浓度SeNP后，ahpF基因均被上调，从侧面印证了细菌暴露于SeNP环境中时，活性氧水平的升高[24]。

3 硒纳米颗粒的生物相容性

尽管SeNP具有良好的抗菌效应，但它仍然具有保护或促进人体正常细胞的功能，这对于植入物的生物安全性十分重要。与硒和硒酸盐相比，SeNP具有更好的生物相容性和更低的细胞毒性[32]。Cremonini等[12]的实验发现，在SeNP环境中，未发现树突状细胞和成纤维细胞的活力丧失、活性氧释放增加、促炎和免疫刺激性细胞因子分泌的现象。浓度为1 ppm的SeNP可以明显抑制铜绿假单胞菌和多重耐药大肠埃希菌的生长；而在72 h内，浓度为1 ppm的SeNP对人皮肤成纤维细胞无明显的细胞毒作用[8]。SeNP对成纤维细胞应激的保护，与其诱导ATF4和Bcl-xL的表达增加，导致细胞在应激状态下的衰减有关[33]。Yazhiniprabha等[34]发现，利用Murrayakoenigii浆果提取物合成的生物SeNP(Mk-SeNP)，在50 μg/mL的浓度下，对革兰阴性菌(痢疾志贺氏菌、铜绿假单胞菌)和革兰阳性菌(粪肠球菌、变形链球菌)均表现出明显的抗菌活性；在25 μg/mL的浓度下，可显著降低上述细菌的生物膜厚度；但直到100 μg/mL，才显示出对山羊红细胞较低的溶血活性，证明了生物合成的SeNP的生物相容性。

4 硒纳米颗粒的临床应用

SeNP在应用途径上多种多样，可根据目的和作用靶点进行不同设计。治疗类风湿关节炎等全身性疾病、消化系统疾病可以选择口服[35]，经肠道吸收分布于全身，或经过肝代谢处理后达到治疗目的。口腔科、骨科为预防假体植入后的继发感染，可将SeNP涂覆在植入物表面[18]，以减少抗生素的使用；同理，也可将其涂覆在导管、插管表面预防医源性感染。SeNP与溶菌酶杂交后负电荷减少，降低了与细菌之间的静电排斥，两者协同作用使抗菌作用增强，可在医疗、生物医学、食品安全中可以得到广泛应用[36]。在生物医用材料领域，硒纳米颗粒凭借其抗菌作用可用于制作抗菌纤维材料、医用敷料及涂层、保健品、医用过滤材料等[37]。

5 结 语

通过一些列体内外实验，SeNP的抗菌作用越来越得到肯定。而对于同一家族的不同菌株来说，SeNP最小抑菌浓度存在差异，这其中的具体原因还有待深入研究。获取SeNP的途径多样，有物理、化学、生物等多种方式；其中，生物合成取材便捷、环境友好，逐渐成为研究热点。金、银、铜等金属纳米颗粒具有良好的抗菌性能[38]，但一些金属纳米材料会刺激树突状细胞及其他免疫细胞释放活性氧和(或)引起超敏反应，给正常组织细胞带来损害[12]。例如，纳米银抗菌水凝胶阴道给药后在短时间内会产生一定浓度的蓄积[39]。硒是人类必需的微量元素，而相比于金属纳米颗粒，SeNP具有毒性低、生物相容性高等优势[40]，因此其应用前景更加广阔。由于其良好的抗菌作用，SeNP可以用来治疗多种疾病，主要涉及细菌感染所致疾病，以及预防假体植入后感染。

对于SeNP抗菌机制的研究，目前大多停留在可以直接观测到的细胞水平，如通过扫描电镜可以观察到细胞膜被破坏、生物膜形成受到抑制，通过荧光标记可以观察到活性氧释放增多等；而在分子层面，即使通过质谱法可以测得蛋白质合成受抑制，其具体作用靶点也尚不明了。明确SeNP的抗菌作用机制及药理作用，有助于根据需要设计不同的药物剂型治疗临床疾病，因此分子水平上SeNP抗菌机制的探索，具有重要研究价值。