蛛网膜腔出血后脑组织氧自由基代谢的实验研究

董广宇+禹婷婷+吴春波+王新军+廖一凡

【摘要】 目的：探讨兔蛛网膜下腔出血（SAH）后脑组织氧自由基代谢的动态变化及意义。方法：24只新西兰大白兔随机分为假手术组（6只）和SAH组（18只），采用血管内穿刺法建立SAH模型，按观察时间点分为SAH第3天组（D3组）、第5天组（D5组）和第7天组（D7组），每组各6只，检测各组脑组织含水量、丙二醛（MDA）含量、总超氧化物歧化酶（T-SOD）活性。结果：与假手术组比较，SAH组各观察时间点脑组织含水量、MDA含量均有明显升高（P<0.05），T-SOD活性均有明显下降（P<0.05），D5组变化最为显著（P<0.01）。结论：兔SAH后脑组织脂质过氧化反应增强，氧自由基清除能力下降，自由基损伤可能是SAH后脑水肿形成的重要病理机制。

【关键词】 兔； 蛛网膜下腔出血； 丙二醛； 超氧化物歧化酶； 脑水肿

【Abstract】 Objective：To investigate the dynamical changes and significance of oxygen free radical metabolism in brain tissues after the experimental subarachnoid hemorrhage（SAH） in rabbits.Method：24 white rabbits of New Zealand were randomly divided into sham operation group of 6 rabbits and SAH group of 18 rabbits.Rabbits model of SAH were made by endovascular puncturing，according to the observation time points they were divided into SAH third days group （group D3）， fifth days group （group D5） and seventh days group （group D7），each group of 6 rabbits.The water content， malondialdehyde （MDA） content， and activity of total superoxide dismutase （T-SOD） of the brain tissues were measured in all groups.Result：Compared with the sham operated group，the SAH groups water content and MDA content increased significantly，T-SOD activity decreased significantly（P<0.05）.Furthermore，all the changes were most significantly in fifth days group after SAH（P<0.01）.Conclusion：There is an enhancement of lipid peroxidation and lower oxygen free radical scavenging ability after SAH.Free radical injury maybe the main pathomechanism of brain edema after SAH.

【Key words】 Rabbits； Subarachnoid hemorrhage； Malondialdehyde； Superoxide dismutase； Brain edema

First-authors address：Peoples Hospital of Longgang District，Shenzhen 518172，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.34.006

自发性蛛网膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）多为颅内动脉瘤破裂所致，再出血因素控制后，如何防治脑血管痉挛（cerebral vasospasm，CVS）、迟发性缺血性神经功能障碍（delayed ischemic neurological deficit，DIND）等相关并发症已成为目前研究的熱点[1-3]。以往国内外研究认为，迟发性CVS或大血管结构的改变是DIND的主要原因，但随机双盲对照的临床研究显示，迟发性CVS的逆转并没有改变患者的总体预后，提示对SAH后复杂病理机制的研究不能仅限于防治迟发性CVS方面[4-5]。本研究采用模拟动脉瘤性SAH动物模型，通过观察脑组织含水量、丙二醛（MDA）含量、总超氧化物歧化酶（T-SOD）活性的动态变化，进一步探讨氧自由基代谢在SAH后继发脑损伤中的作用及意义，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和器材 MDA测试盒、SOD测试盒、总蛋白定量测试盒（南京建成生物工程研究所），分析天平（德国sartorius公司），干燥箱（广州东方电热干燥设备厂），组织研磨器（河北涿州玻璃仪器厂），离心机（美国Beckman公司），分光光度计（福建新大陆生物技术有限公司），EXCEL-14微导管（Boston公司），0.010in Transend微导丝（Cordis公司）。

1.2 实验动物及分组 24只新西兰大白兔（第一军医大学实验动物中心提供，雌雄不限，体重2.5～3.5 kg），随机分为假手术组（6只，导丝进入但未刺破颈内动脉）及SAH组（18只），后者按观察时间点又随机分为SAH第3天组（D3组）、第5天组（D5组）和第7天组（D7组），每组各6只。

1.3 动物模型制作 采用经股动脉血管内穿刺法制作兔SAH模型[6]，30%乌拉坦溶液2.0～3.0 mL/kg经耳缘静脉注射麻醉成功后，仰卧位固定于自制手术台，腹股沟区常规消毒、铺无菌巾单，分离、暴露股动脉，Seldinger法股动脉穿刺置4F导管鞘，经导管鞘引入4F猎人头Ⅰ型导管，在0.035in超滑导丝辅助路图指引下置于右（左）颈总动脉中上段，随后引入预塑形的EXCEL-14微导管和Transend微导丝，路图指引下微导管置于颈内动脉，然后换用剪除柔软头端的Transend微导丝，DSA监视下经微导管送入颈内动脉后，快速将导丝推出导管约1 cm，重复2次后退出导丝，拔出导管及动脉鞘，结扎股动脉并缝合皮肤切口。

1.4 SAH判断 颈内动脉穿刺后即刻出现的CVS及不同程度的行为学异常，如心率迅速加快、呼吸急促或呼吸骤停、四肢强直样改变或大小便失禁等。术后因SAH或CVS而表现出不同程度的神经功能障碍[7]，如精神差、嗜睡、拒食、活动减少等轻度神经功能障碍，肢体无力、跛行、单瘫等中度神经功能障碍，划圈运动、行走困难、四肢瘫痪等重度神经功能障碍。术后经枕大池穿刺抽取脑脊液，大体观察并经实验室检查证实为血性脑脊液。

1.5 标本采集与处理 各组实验动物按不同观察时间点，在静脉全麻成功后，以0～4 ℃冰盐水经颈动脉灌注并放血处死动物，立即开颅取脑，迅速置于冰盐水中漂洗并剥除脑膜及血管，滤纸拭干后放入液氮中保存，用于脑组织含水量、MDA含量及SOD活性测定。

1.6 观察指标与检测方法

1.6.1 脑组织含水量测定 按干湿重法，取脑组织块用分析天平称取湿重后置于110 ℃恒温干燥箱中烘干24 h至恒重，按公式计算脑组织水含量百分比：脑组织含水量=（组织湿重-组织干重）/组织湿重×100%。

1.6.2 脑组织MDA含量、T-SOD活性测定 取脑组织块用预冷（0～4 ℃）匀浆介质（0.01 mol/L Tris-HCl，0.0001 mol/L EDTA-2Na，0.01 mol/L蔗糖，0.8%NaCl，pH 7.4）按1∶9质量比在组织研磨器中充分研磨至显微镜下观察细胞完全破碎，3000 r/min低温（0～4 ℃）离心15 min，留上清待测。蛋白定量采用双缩脲法，MDA含量测定采用硫代巴比妥酸（TBA）法，T-SOD活性测定采用羟胺法，单位分别为毫克蛋白每毫升（mg pro/mL）、纳摩尔每毫克蛋白（nmol/mg pro）、亚硝酸盐单位每毫克蛋白（NU/mg pro）。

1.7 统计学处理 使用SPSS 16.0统计软件进行分析，计量资料采用（x±s）表示，比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SAH模型制作成功率 假手术组6只兔完成各实验步骤，未出现增补；SAH组兔共增补6只，总数为24只，制作SAH模型并获取标本18只，成功率为75%（18/24）。模型失败原因：颈内动脉穿刺后实验动物即刻呼吸、心跳骤停经抢救无效死亡2只，术后经枕大池穿刺检查未发现血性脑脊液3只，观察期间死亡1只。

2.2 动物行为学观察 假手术组动物手术前后饮食、精神状态、活动情况及神经功能无明显变化。SAH组动物在穿刺出血后即刻有心率迅速加快、呼吸急促、肢体强直样改变等表现，手术24 h以后5只动物出现轻度神经功能障碍，10只动物出现中度神经功能障碍，3只动物出现重度神经功能障碍。神经功能障碍以术后6～12 h较差，24 h后有所恢复，5 d时癥状又有加重表现。

2.3 两组脑组织含水量、MDA含量、T-SOD活性比较 与假手术组比较，SAH后各时间点脑组织含水量、MDA含量均有明显升高，T-SOD活性均有明显下降（P<0.05）。动态观察显示，脑组织含水量、MDA含量在SAH后第3～5天呈升高趋势，第5～7天呈下降趋势，但总体水平仍高于正常；T-SOD活性则呈反向变化趋势，即SAH后第3～5天呈下降趋势，第5～7天呈上升趋势，但总体水平仍低于正常，见表1。

3 讨论

自发性蛛网膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）是临床常见的脑血管意外之一，具有发病急、致死率高、预后差等临床特点，目前对SAH的临床和实验研究多集中在脑血管痉挛（cerebral vasospasm，CVS），尤其迟发性CVS和迟发性缺血性神经功能障碍（delayed ischemic neurological deficit，DIND）的防治方面[8-11]。但是随着对迟发性CVS不能解释的神经功能障碍的重视和疾病早期预警及干预的临床需要，SAH后脑损伤尤其早期脑损伤的研究越来越受到医学界的重视。SAH后脑损伤是多种病理过程共同导致的神经元功能障碍或凋亡，其中包括了早期颅内压升高、短暂脑缺血缺氧、血液分解产物的生化刺激、机体后续的氧化应激、炎症反应、血管病理性收缩等。氧化应激由SAH急性期脑缺血再灌注启动，由释放入蛛网膜下腔的血红蛋白裂解产物加重，通过促进脂质过氧化、蛋白氧化、导致DNA损伤并激活凋亡通路及炎症级联反应加重脑损伤，参与血管平滑肌及内皮损伤、血脑屏障破坏、血管痉挛、细胞凋亡等多个病理机制[12-13]。兰新强等[14]在自由基清除剂对减少大鼠SAH后CVS的研究中发现，SAH后第1天基底动脉白介素6（IL-6）、细胞间粘附分子1（ICAM-1）在mRNA水平上即有表达上调，分别在第3、5天达到高峰，经依达拉奉治疗后上述表达明显减弱，认为自由基在CVS之初即被激活并通过调控多种基因的表达参与CVS的形成，抑制自由基活化能有效缓解CVS。王蔚等[15]研究中显示，大鼠SAH后海马CA1区细胞凋亡数目逐渐增加，至72 h达峰值，依达拉奉干预可有效升高Bcl-2、降低Bax的表达水平，证实自由基清除剂能有效抑制SAH后引起的大鼠海马CA1区神经细胞凋亡。

氧化应激本质是细胞内自由基产生和清除失衡、活性氧自由基过量堆积的结果。自由基如超氧阴离子、一氧化氮、过氧化氢、过氧化亚硝基和高活性羟自由基等含有未配成对电子，具有强烈生物氧化活性。生理状态下自由基生成与清除处于动态平衡，维持在相对低水平，在调节细胞间信号传递、诱导细胞增殖和凋亡、抑制病毒和细菌等方面起重要作用。病理状态下自由基过量生成及抗氧化物质如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、还原型谷胱甘肽、过氧化氢酶等活性下降或过量消耗，可通过一系列损伤性级联反应引起细胞膜系脂质、蛋白质、核酸等生物分子结构和功能的改变，导致细胞和组织损伤。脑组织具有较高的氧化代谢率、高密度的膜不饱和脂肪酸以及依赖胞膜结构和功能完整的突触传导，与其他组织相比更易受到自由基介导的损伤[16-17]。

由于自由基半衰期短，很难被直接测定，目前相关研究多基于自由基的化学反应及氧化剂-抗氧化剂平衡的理论，采用间接的方法来检测或反映自由基的产生[18]。MDA是脂质过氧化反应的最终产物之一，其浓度可反映脑组织中氧自由基浓度和脂质过氧化程度，进而间接反映机体清除氧自由基的能力。超氧化物歧化酶（SOD）按所含金属辅基不同分为铜锌超氧化物歧化酶（Cu/Zn-SOD）和锰超氧化物歧化酶（Mn-SOD），前者主要存在于胞浆，后者主要存在于线粒体，是体内重要的抗氧化酶和氧自由基清除剂，二者活性相加即为总超氧化物歧化酶（T-SOD）活性，可直接反映机体清除氧自由基的能力。本实验采用血管内穿刺法模拟动脉瘤性SAH，通过观察脑组织含水量、MDA含量、T-SOD活性的动态变化，研究自由基代谢在SAH后继发脑损伤中的作用。结果显示，MDA含量在兔SAH后脑组织中明显增加，第3～5天呈升高趋势，第5～7天呈下降趋势，但总体水平仍高于正常；脑组织T-SOD活性则呈反向变化趋势，即在第3～5天呈下降趋势，第5～7天呈上升趋势，但总体水平仍低于正常；脑组织含水量变化与MDA含量变化相似。研究结果与文献[19]一致，说明SAH后脑组织脂质过氧化反应活跃，主要的氧自由基清除剂SOD因消耗增加而减少，提示自由基代谢紊乱可能是SAH后脑水肿的重要病理机制之一。

SAH后颅内压升高、CVS引起的脑缺血缺氧性损害及蛛网膜下腔血液分解产物氧合血红蛋白的聚集利于自由基的大量生成，自由基过量形成又加剧CVS及脑缺血缺氧性损害[20]。因此，在目前单独应用CVS不能合理解释SAH不良预后的情况下，积极探索自由基损伤的病理机制及有效干预措施，将在SAH多靶点治疗中具有重要的实际意义。

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