miR-141-5p在特发性少精子症和无精子症中的表达及临床意义

王辉，周俊，冯奕

男性不育发病率近年来呈上升趋势[1]。microRNA（miRNA）是一系列单链非蛋白编码小RNA分子，在转录后水平调控基因表达，可游离于体液中[2]。血清、胸腹水等体液miRNA已显示其作为疾病诊断生物标志的巨大潜能。同样精浆miRNA在生殖疾病病因学研究方面和生殖遗传研究领域也具有诸多优势，精浆miR-141表达与精子的发生和形成有关[3]。本研究通过观察miR-141-5p在特发性少精子症和无精子症中的表达，为临床诊治提供新的一种分子标志物，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 参照WHO《人类精液检查与处理实验室手册》（第5版）标准，选择特发性少精症（精子浓度＜15×106/ml和精子总数＜39×106/一次射精）37例，年龄25～39岁，平均（32.1±4.4）岁；特发性无精症（精液3 000 r/min离心15 min沉淀物中没有精子）29例，年龄26～42岁，平均（31.5±6.7）岁。每例患者精液均常规分析3次以上，每次检测间隔2个月；排除精液量异常、血精、液化不良、畸形精子症、精液白细胞数≥1×106/ml以及高热病史、自身免疫性疾病和接触化学及放射性物质的相关职业者。另外选择同期因女方不孕，男方生育能力评估正常的健康男性30例，设为正常对照组，年龄25～39岁，平均（30.2±5.4）岁。3组年龄结构、身体基础等方面具有可比性，所有对象均签署知情同意书并经医院伦理委员会同意。

1.2 标本采集方法 依WHO要求，禁欲3～7d，排小便，并洗净双手和阴茎，再以0.1 mg/ml新洁尔灭对外尿道口消毒，手淫法收集全部精液于干燥消毒的精液釆集器内，置37℃多维混匀恒温箱，待充分液化后行精液常规分析，3 000 r/min离心15min，取精浆1～2ml，置－80℃冰箱保存。

1.3 实验方法

1.3.1 精液常规质量参数分析 用北京伟力计算机辅助精子分析系统（CASA），在带有加热37℃载物台的显微镜下用已预热和已校正的高精度双池网格精子计数板分析精子浓度和前向运动精子百分率，双池检测结果在95%CI内方可判定有效。精子存活率采用低渗膨胀实验（HOS），精子形态采用改良Diff-Quick染色法，试剂由BASO公司生产并提供，各标本由不同的两人平行测定2次，取平均值，两次结果偏倚≥10%重新实验。

1.3.2 精浆游离microRNA的提取（1）预处理，取200 l液化后精浆加入2 l 100 g/ml蛋白酶K（美国Sigma公司）于37℃水浴箱1 h后，再加入250 l 1×TRI-reagent buffer和0.018 g PEG20000（美国Sigma公司）充分混匀，于室温下放置15min，然后12000r/min，4℃离心10 min，取上清液用于TRIzol法提取RNA。（2）TRIzol法提取RNA，取200 l预处理的精浆加入0.75ml TRIzol（美国Invitrogen公司）中充分均匀，将匀浆液倒入1.5 ml离心管中，再依次加入氯仿、异丙醇及95%乙醇，获得总RNA。（3）提取效率评估，取2 l RNA溶液，加98 l水，混匀后经DU800紫外分光光度计（美国Beckman公司）测定A260/A280比值，1.8～2.0提示无DNA及蛋白质污染。

1.3.3 实时荧光定量聚合酶链反应RTPCR（1）cDNA的合成：按照TaqManReverse Transcription Buffer 1.50 l，RNase Inhibitor 20 U/l 0.19 l，Nucleasefreewater4.16 l。15 l逆转录反应体系：RT master mix 7 l，total RNA 5 l，RT primer 3 l。逆转录反应条件：16℃30 min；42℃30 min；85℃5 min；4℃。（2）miR-141-5p及内参U6 snRNA扩增：根据TaqMan MicroRNA Assays（ABI公司）提供的引物及探针进行扩增，20 l PCR反应体系：TaqMan Universal PCR Master Mix II 10.00 l，Nuclease-free water 7.67 l，TaqMan Small RNA Assay（20×）1 l，ProductfromRTreaction1.33 l。PCR反应条件：50℃2min；95℃10min；95℃15 s；60℃60 s；40次，仪器用美国Stratagene公司Mx3000P型实时荧光定量PCR仪。

1.3.4 结果计算 精浆miR-141-5p表达量采用相对定量2-Ct方法Ct=CTmiR-141-5p－CTU6snRNACt=Ct不育患者－Ct正常对照。

1.4 统计方法 采用SPSS17.0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差表示，两组比较采用 检验，多组比较采用方差分析，多重比较采用LSD法；诊断效能分析采用受试者操作特征（ROC）曲线。＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组精液常规主要质量参数比较各组精子浓度差异有统计学意义（＜0.05），其他各质量参数差异均无统计学意义（均＞0.05），见表1。

表1 各组精液常规主要质量参数比较

2.2 各组精浆miR-141-5p的表达 各组精浆miR-141-5p的表达差异有统计学意义（=12.224＜0.05）。与正常对照相比，特发性少精症和特发性无精症精浆miR-141-5p表达显著增高（=4.628、4.767，均＜0.05），特发性无精症与特发性少精子症间差异有统计学意义（=2.213＜0.05），见封三彩图3。

2.3 精浆miR-141-5p对特发性少精症和特发性无精症的临床价值miR-141-5p诊断特发性无精症曲线下面积为0.920（95%0.855～0.984），当选择最佳临界值4.93时，其诊断敏感性为93.1%，特异性为76.7%。miR-141-5p诊断特发性少精症曲线下面积为0.879（95%0.809～0.948），当选择最佳临界值5.36时，其诊断敏感性为96.3%，特异性为72.9%。见封三彩图4～5。

3 讨论

不育症与心血管疾病、肿瘤已成为21世纪三大健康问题[4]。在我国，有15%～20%的育龄夫妇不能生育，男性因素约占50%[5]。男性不育致病原因复杂，开展的相关研究特别是微观领域的研究尚很缺乏。近年来，世界各地科研工作者和临床医生已在分子领域对男性不育症进行探索并取得了一定进展。

microRNA广泛存在于人类的血液、尿液、唾液、痰液、精液、胸腹水、羊水及乳汁等体液中，在疾病的诊断和预后方面已经显示了其独特的应用价值。miRNA在精液中也非常的丰富，并且稳定存在[6-7]，前期研究也表明，一些miRNA分子在男性不育中有相当的临床价值[8-9]。有研究发现，Dicer酶缺陷的老鼠，其生精小管内含有的圆形精子细胞数量较少，甚至还有一些异常的延伸精子细胞，延伸精子细胞通常表现出形态畸形和运动力低下等特点，这些因素均可以增加不育症的发生率，因此miRNA可以作为一个关键因素决定生殖细胞的数量及功能。miR-141是miR-200家族成员之一，主要参与上皮-间充质转化（EMT）、增殖、迁移、侵袭及耐药等多种细胞过程。miR-141-5p属于miR-141-5基因家族一员，参与细胞周期、凋亡的调控，与精子的发生、凋亡关系密切[10]。本研究发现特发性少精症、特发性无精症患者精浆miR-141-5p表达上调，与对照组相比有显著性差异。miR-141-5p对特发性少精子症和特发性无精症均有很好的诊断价值分别为0.879（95%0.809～0.948），0.920（95%0.855～0.984），并且两者敏感性和特异性均较高。这提示miR-141-5p功能表达与精子的发生和形成有关，可作为诊断特发性少精症和特发性无精症较好的分子标志物。