经典名方温胆汤水煎液HPLC指纹图谱与多成分含量测定研究

张琴,王佳丽,高喜梅,陆超颖,狄留庆

(1.海安市中医院药学部,江苏 南通 226600;2.南京中医药大学药学院,江苏 南京 210023;3.江苏省中药高效给药系统工程技术研究中心,江苏 南京 210023)

温胆汤源于南北朝名医姚僧垣所撰的《集验方》,始见于唐代孙思邈的《备急千金要方》,由半夏、竹茹、枳实、陈皮、生姜、甘草6味药材组方而成。温胆汤以半夏为君,燥湿化痰,降逆和胃;竹茹为臣,清胆和胃，止呕除烦,二者相伍,既化痰和胃,又清胆热;枳实、陈皮理气化痰,生姜和中培土且制半夏之毒,为佐药;佐使以甘草,益脾和中,调和诸药。针对温胆汤,历代医家多有加减化裁的灵活运用,以适应具体病机病证或调节治疗力度,但均保留了最基本的组方和功效[1-2]。

中药化学物质基础研究是开展质量评价、质量控制的关键[3]。特征性成分含量控制以及指纹图谱对照是常见的中药质量评价方法。复方制剂通常对指标性成分含量测定来进行质量控制。中药指纹图谱[4-5]是对中药已知成分和未知成分进行整体评价和分析的质量控制方法。该方法适用于某些活性成分研究尚不完善但确有临床疗效的中药,通过指纹图谱中的整体相似性评价以及已知活性成分的定量分析来评判该中药质量的优劣[6]。温胆汤目前的研究多集中在临床应用与药效机制方面[7],方中半夏[8-10]、枳实[11-12]、陈皮[13-14]、甘草[15-17]等单味药材虽有其相关指纹图谱的报道,但对于全方的整体质量控制研究较为匮乏。由于温胆汤中药味较多,且不同产地、批次的药材存在一定质量差异,因此需要对全方进行质量控制。本研究通过建立温胆汤水煎液的指纹图谱与多成分含量测定方法,为经典名方温胆汤的整体质量控制与评价提供参考。

1 材料

1.1 仪器

Waters e2695型高效液相色谱仪(美国Waters公司),KH-500DE型超声波清洗器,Sartorius CPA225D电子天平(德国Sartorius公司),XP6型百万分之一电子天平(瑞士Mettler Toledo公司),101-00B型电热恒温干燥箱(绍兴市沪越仪器设备厂),Labconco真空冷冻干燥机(美国Labconco公司),Milli-Q Synthesis 108超纯水仪(美国Milli-Q公司),RE-52AA旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂),DZ-A/BCIV真空干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司)。

1.2 试剂和试药

乙腈、甲醇(LC-MS级,Merck公司),乙醇、甲酸(分析纯,国药集团化学试剂有限公司);柚皮苷(110722-201714,93.4%)、橙皮苷(110721-201617,96.1%)、新橙皮苷(111857-201703,99.2%)、甘草苷(111610-201607,93.10%)均购于中国食品药品检定研究院;芸香柚皮苷(P11N8L48150)、柚皮素(YJ0603HA13)、橙皮素(C03F6Y1)、川陈皮素(H22M8K32109),甜橙黄酮(P14M6R1),3,5,6,7,8,3,4'-七甲氧基黄酮(C09O8Y45293),桔皮素(H09M7K14409)均购于上海源叶生物科技有限公司,纯度均大于98%。

药材由南通精华制药有限公司提供,经检测均符合2020年版《中国药典》标准,具体信息见表1。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Waters X-Bridge C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),保护柱为Phenomenex Widepore C18(4 mm×3.0 mm),流动相为乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B),梯度洗脱程序为:0～5 min,5%A;5～30 min,5%～18.5%A;30～45 min,18.5%A;45～55 min,18.5%～32%A;55～75 min,32%～46%A;75～76 min,46%～75%A;76～80 min,75%A;80～81 min,75%～5%A;80～85 min,5%A;检测波长为310 nm;流速为1 mL·min-1;柱温为30 ℃;进样量为10 μL。

2.2 对照品溶液的制备

取甘草苷、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素、橙皮素、甜橙黄酮、川陈皮素、3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黄酮、桔皮素11种对照品适量,加甲醇配制成浓度分别为55.72、234.40、872.50、235.11、537.29、15.63、13.97、13.80、37.53、13.44、14.96 μg·mL-1的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

古籍记载:“半夏、竹茹、枳实各二两,橘皮三两,生姜四两,甘草一两。上六味咀,以水八升煮取二升,分三服”[18]。参照该方所处唐宋时期的剂量折算方式[19-20],一两相当于15.625 g,一升相当于204 mL,则该方折合为现代剂量即:半夏31.25 g,橘皮46.875 g,竹茹31.25 g,枳实31.25 g,生姜62.5 g,甘草15.625 g,将上述药材粉碎至黄豆粒大小置于砂锅中,加水1 632 mL,以武火煮沸后换成文火煎煮至滤液408 mL,9号筛过滤。水煎液置旋转蒸发仪(真空度为0.1 kPa,转速为60 r·min-1,温度为70 ℃)中浓缩至含生药量约为4.0 g·mL-1,置-80 ℃冰箱中冷冻过夜,迅速取出进行冷冻干燥,得冻干粉样品。将冻干粉研磨均匀,分别精密称取相当于2 g温胆汤药材的冻干粉,置50 mL容量瓶中,加入4/5体积的50%乙醇,超声(功率250 W,频率40 kHz)45 min,放冷后定容,摇匀,离心(14 000 r·min-1,10 min),取上清液,以0.45 μm微孔滤膜过滤,即为供试品溶液。

2.4 指纹图谱研究

2.4.1 精密度考察 精密吸取“2.2”项下对照品溶液10 μL,按“2.1”项下色谱条件测定,连续进样6次,在310 nm波长下以新橙皮苷为参照(S),计算其他共有峰相对保留时间的RSD值。表2结果表明,其他24个共有峰与新橙皮苷之间的相对保留时间RSD值均小于3%,表明仪器精密度良好。

表2 精密度考察结果

2.4.2 稳定性考察 取同一供试品溶液,照“2.1”项下色谱条件分别在溶液制备后0、2、4、8、12、24 h进样分析,以新橙皮苷为参照(S),计算各共有峰相对保留时间的RSD值。表3结果表明,其他24个共有峰与新橙皮苷之间的相对保留时间RSD值均小于3%,表明样品稳定性良好。

表3 稳定性考察结果

2.4.3 重复性考察 再取同一冻干粉按“2.1”项下方法平行制备供试品溶液6份,按“2.1”项下色谱条件进样测定,以新橙皮苷为参照(S),计算各共有峰相对保留时间的RSD值。表4结果表明,其他24个共有峰与新橙皮苷之间的相对保留时间RSD值均小于3%,表明本方法重复性良好。

表4 重复性考察结果

(续表)

2.4.4 指纹图谱共有模式的建立及部分共有峰的指认 利用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)》处理15批温胆汤色谱图数据,以其中的S1图谱作为参照谱,使用中位数进行自动匹配,加以多点校正,生成指纹图谱共有模式。在指纹图谱中可分别标定出25个共有峰,且各样品中共有峰峰面积均占总峰面积的80%以上。通过与混合对照品保留时间及紫外吸收光谱图比对,指认出甘草苷、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、川陈皮素、桔皮素7个共有峰以及柚皮素、橙皮素、甜橙黄酮、3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黄酮4个非共有峰。见图1。

注：14.甘草苷；17.芸香柚皮苷；18.柚皮苷；19.橙皮苷；20.新橙皮苷；24.川陈皮素；25.桔皮素；a.柚皮素；b.橙皮素；c.甜橙黄酮；d.3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黄酮图1 温胆汤指纹图谱共有峰

以共有模式作为对照指纹图谱,对15批温胆汤图谱进行相似度评价,发现相似度均大于0.95(表5),表明该15批温胆汤水煎液之间相似度良好。样品叠加图见图2。

2.5 温胆汤中11种成分含量测定

2.5.1 方法学考察 分别吸取20、15、10、8、4、2、1 μL混合对照品,按“2.1”项下色谱条件进样分析,以对照品溶液的相对质量浓度为横坐标(x),以峰面积为纵坐标(y),绘制标准曲线,结果表明(表6),11种成分的线性关系良好。

表5 15批温胆汤的相似度评价结果

图2 温胆汤指纹图谱叠加图

表6 11个成分的回归方程与线性范围

精密吸取“2.3项”下供试品溶液10 μL连续进样6次,再取“2.3”项下同一供试品溶液,分别在溶液制备后0、2、4、8、12、24 h进样分析,记录各成分在310 nm波长下的峰面积,并计算其RSD值,结果显示各成分的峰面积RSD值均小于5%,表明仪器精密度良好、供试品溶液稳定性良好。

再取同一冻干粉按“2.3”项下方法平行制备供试品溶液6份,记录各成分在310 nm波长下的峰面积,并计算各成分含量的RSD值,结果表明各成分含量的RSD值均小于5%,表明样品处理方法的重复性良好。

取0.1 g同一冻干粉,精密称定,置50 mL容量瓶中,精密移取含甘草苷42.5 μg·mL-1、芸香柚皮苷111.6 μg·mL-1、柚皮苷552.1 μg·mL-1、橙皮苷161.3 μg·mL-1、新橙皮苷670.0 μg·mL-1、柚皮素5.6 μg·mL-1、橙皮素3.0 μg·mL-1、甜橙黄酮7.5 μg·mL-1、川陈皮素10.7 μg·mL-1、3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黄酮6.8 μg·mL-1、桔皮素4.3 μg·mL-1的混合对照品溶液10 mL,按“2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液,进样,记录各成分在310nm波长下的峰面积,并计算11种成分的回收率及其RSD值。结果表明各成分的回收率均在95%～105%范围内,且RSD值均小于5%,说明本方法回收率结果良好。

2.5.2 含量测定结果 样品与混合对照品HPLC图谱见图3。温胆汤中的11个成分相对于总药材的含量测定结果见表7。

1.甘草苷；2.芸香柚皮苷；3.柚皮苷;4.橙皮苷;5.新橙皮苷;6.柚皮素;7.橙皮素;8.甜橙黄酮;9.川陈皮素;10.3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黄酮;11.桔皮素图3 样品(A)与混合对照品(B)HPLC图谱

表7 温胆汤中11个成分含量测定结果(mg·g-1)

3 讨论

《备急千金要方》记载:“大病后,虚烦不得眠,此胆寒故也,宜服此温胆汤方”[18]。南宋陈无择的《三因极一病证方论》中所载温胆汤“半夏、竹茹、枳实各二两,陈皮三两,甘草一两,茯苓一两半。上锉为散,每服四大钱,水一盏半,加生姜5片,大枣1枚,煎七分,去渣,食前服”[21],实乃《千金方》中温胆汤加茯苓、大枣演化而来,所治病证为“心胆虚怯,触事易惊,或梦寐不祥,或异象惑,或短气悸乏,或复自汗,四肢浮肿,饮食无味,心虚烦闷,坐卧不安”[21]。历代医家灵活运用、随证加减,既取温胆汤原方配伍之妙,又化裁形成20余种系列类方[22],其临床应用也不断扩展[23]。

近年来,国家对经典名方的研发给予了高度重视与大力支持。目前经典名方研究最大的特点即“遵古”,如何做到“遵古”即需要以古代医籍文献的记载为基础,以现代工艺技术为桥梁,实现古法制备与现代工艺之间的转化。古今环境差异之大,这便要求研究过程中既要“遵古”,还需同时考虑现代制备合理性[24]。《古代经典名方目录(第一批)》中关于温胆汤的记载为“半夏、竹茹、枳实各二两,橘皮三两,生姜四两,甘草一两。右六味,咀,以水八升煮取二升,分三服”。“咀”即为将药材磨碎,温胆汤方所处时期为唐宋,该时期的一两相当于现今15.625 g,一升相当于现今204 mL。此外,根据明代李时珍“古之一两,今之一钱”的说法以及现今临床常用剂量,从安全性、成药性来综合考虑,1两折合现今3 g也可作为一种重要的参考依据[25-26],但此种换算仅为医家的临床经验所得,并非严格的唐代原方剂量,故最终确定温胆汤古代煎煮工艺条件为:称取1个处方量“咀”后(粉碎至黄豆粒大小)的药材放置于砂锅中,加水约1 600 mL,以武火煮沸后换成文火煎煮至滤液约为400 mL,9号筛过滤。本试验前期研究发现以50%乙醇为溶剂提取的供试品色谱图信息量丰富,且11种已知成分分离度较好,保留时间及峰面积相对较稳定,故选择以50%乙醇为提取溶剂。在不同波长下,通过分析比较图谱的峰数目、峰形、分离度、对称因子、理论塔板数等参数发现,上述色谱参数在波长310 nm条件下信息均相对较好,故选择310 nm为指纹图谱和含量测定的分析波长。

本文建立了温胆汤水煎液的指纹图谱,确定了其中的25个共有峰,并指认出了甘草苷、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、川陈皮素、桔皮素7个共有峰以及柚皮素、橙皮素、甜橙黄酮、3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黄酮4个非共有峰。15批温胆汤水煎液的指纹图谱与对照指纹图谱的相似度均≥0.95,说明该制备工艺较为稳定。以指认出的11个成分作为指标进行含量测定,发现柚皮苷、橙皮苷与新橙皮苷含量较高,现代药理研究证明这三种成分具有化痰止咳、改善失眠的功效[27-29],与温胆汤所治“痰热内扰之失眠”相契合。考虑到方中半夏具有一定毒性,课题组后期会对药材进行炮制并考察指标性成分的转移率,进一步对以饮片投料的温胆汤水煎液进行考察。本研究照古籍所记载的工艺制备温胆汤水煎液,相应指纹图谱与多成分含量测定的方法操作简便、稳定可行,能够应用于多批次温胆汤的质量分析,可为后续建立经典名方温胆汤的质量控制标准提供参考。