补肾健脾方对卵巢早衰小鼠ER/c-Myc/TERT信号通路调控的影响

王海丹,郭红玉,王琼,严士海,符蕊,殷爱玲

(1.南京中医药大学附属医院,江苏省中医院,江苏 南京 210029;2.南京中医药大学附属南京中医院,江苏 南京 210001)

卵巢早衰(Premature ovarian failure,POF)是临床常见的与内分泌相关的妇科疾病之一，导致年龄低于40岁的女性出现闭经、促卵泡生成激素(FSH)水平升高(>40 U·L-1)和雌二醇(E2)水平降低,并伴有不同程度的潮热出汗、烦躁易怒、记忆力减退、心悸失眠、腰腿酸痛、胸闷头痛等围绝经期症状[1-2],是早发性卵巢功能不全(Premature ovarian insufficiency,POI)的终末阶段[3-4]。POF的女性常伴随生育力下降或丧失、骨质疏松、心脑血管疾病以及性激素波动,易产生情绪激动、易怒或情绪低落、无法自控等。这些身体和精神上的改变严重影响女性及其家人的生活质量,被视为是一种“社会化生活危机”。POF发病率逐年上升,急需寻求有效的治疗方案,尤其是针对其发病机制的靶向治疗,最终改善患者的卵巢功能,已成为临床研究的热点[5]。

目前,雌激素替代法(HRT)仍是POF的主要治疗手段,但存在副作用大、作用单一及有较多禁忌症等缺点[6-8]。除了HRT外,有报道间充质干细胞对POF中的细胞、动物模型都有较好的治疗效果[9-11]。另外,中医药也已成为POF的主要治疗方法之一,并具有独特的疗效优势。中医认为肾主生殖,肾虚血亏,冲任失调是POF的主要病机,故治疗POF重在调补肾阴肾阳、益养冲任胞宫。调补冲任针刺法辅治POF可有效调节激素分泌水平,改善卵巢功能[12-13]。补肾中药及方剂在治疗POF方面也取得了一定的疗效[14-15]。国医大师夏桂成教授根据补肾健脾治法,创制补肾健脾方用于防治POF。前期临床试验和动物实验均证实,补肾健脾方能明显提高患者血清和大鼠卵巢颗粒细胞的E2水平,且促使卵泡发育,对改善卵巢储备功能,预防及延缓POF的发生有很好的作用[16-17]。卵巢内的信号转导通路十分复杂,而ER/c-Myc/TERT信号通路与端粒酶活性调控密切相关,ER/c-Myc/TERT信号通路异常有可能会影响卵巢功能,从而导致POF的发生。前期各项研究表明补肾健脾方可明显地促进E2分泌和ER的激活,其是否通过ER/c-Myc/TERT信号通路来调控端粒酶活性,进而促进卵巢颗粒细胞的增殖发育以及卵母细胞的成熟，值得研究。本实验旨在阐明这一机制,为补肾健脾方的临床应用奠定更有力的实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级健康雄性A/J小鼠20只,8周龄,体质量18～22 g,由江苏集萃药康生物科技有限公司提供,实验动物许可证号:SCXK(苏)2019-0009。SPF级健康雌性C57BL/6小鼠20只,8周龄,体质量18～22 g,由斯贝福(北京)生物技术有限公司提供,实验动物许可证号:SCXK(京)2019-0010。将C57BL/6雌鼠和A/J雄鼠进行交配,繁育出B6AF1小鼠。将所有繁育出的雌性小鼠在7周龄后每天定时检查动情周期变化,筛选出1周内具有正常动情周期的B6AF1小鼠50只,体质量18～22 g。实验小鼠饲养于江苏省中医院实验动物中心SPF级环境中,分笼饲养,环境温度为(20±2)℃,相对湿度维持在45%～65%,照明12 h更替,自由饮水饮食。所有操作均符合南京中医药大学附属医院实验动物伦理要求(审批号:2019DW-09-02)。

1.2 实验药物及试剂

补肾健脾方由鳖甲10 g，续断10 g，何首乌10 g，枸杞子10 g，白术10 g，茯苓10 g组成,所有药材由江苏省中医院朱玉凤主任中药师鉴定符合标准,并由制剂部加工提取,浓缩液加水制备成含生药量1.716 g·mL-1的药液作为补肾健脾方高剂量,并倍比稀释成含生药量为0.858 g·mL-1的药液作为补肾健脾方低剂量;戊酸雌二醇片购于拜耳医药有限公司(批号:470A),制备成0.052 mg·mL-1的药液;弗氏不完全佐剂购于Sigma公司(批号:SLBT0114);弗氏完全佐剂购于Sigma公司(批号:SLBT1714);小鼠透明带3(ZP3)的第330～342个氨基酸序列(NSSSSQFQIHGPR)购于上海吉尔生化有限公司(分析纯度:96.91%,批号:271036);E2试剂盒购于北京华英生物技术研究所(批号:20210118);FSH试剂盒购于北京华英生物技术研究所(批号:20210116);Donkel试剂盒购于武汉赛维尔生物科技有限公司(货号:SA00013-5);ER、c-Myc、TERT、GAPDH抗体购于Abcam公司(货号:ab92516、ab32072、ab191523、ab8245)。

1.3 主要仪器

FA1004型电子分析天平购于上海精科天平厂;5415D离心机购于Eppendorf公司;XH-6020全自动放射免疫计数仪购于西安核仪器厂;Eclipse C1正置荧光显微镜购于Nikon公司。

1.4 造模及给药

将具有正常动情周期的50只B6AF1小鼠随机分为5组:正常组、模型组、阳性药组、补肾健脾方高剂量组、补肾健脾方低剂量组。将1 mmol·L-1的ZP3溶液分别与弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂按1∶1体积比例配制成免疫试剂和免疫强化试剂。小鼠尾根部皮下多点注射造模。每次免疫时正常组小鼠每只予0.15 mL生理盐水。其余各组首次免疫时每只注射0.15 mL免疫试剂,14 d后每只再予0.15 mL免疫强化试剂,28 d后再进行免疫加强,操作同第2次。末次免疫后1周检查动情周期变化以确定建模是否成功[18-20]。造模结束后,阳性药组灌胃戊酸雌二醇0.52 mg·kg-1,补肾健脾方高、低剂量组分别灌胃补肾健脾方17.16、8.58 g·kg-1,正常组和模型组给予同等体积的蒸馏水,每日1次,连续给药4周。

1.5 观察动情周期变化

每天定时用吸有生理盐水的胶头滴管取阴道分泌物,将其滴入培养板,置于倒置生物显微镜下观察阴道细胞形态,记录小鼠动情周期的变化[21]。

1.6 放射免疫法测定小鼠血清E2、FSH水平

实验结束后,各组小鼠眼眶后静脉丛取血,离心,取血清。使用全自动放射免疫计数仪测定小鼠血清E2、FSH水平。

1.7 小鼠卵巢病理学观察

取一侧卵巢,将其固定在4%多聚甲醛中,按顺序石蜡包埋、切片,行常规HE染色,光镜观察,进行卵巢组织病理学评估。

1.8 免疫荧光法检测卵巢透明带的变化

石蜡切片脱蜡至水、抗原修复、画圈血清封闭、加一抗,DAPI复染细胞核、淬灭组织自发荧光、封片、镜检拍照。荧光显微镜下观察DAPI染色的细胞核在紫外的激发下为蓝色,阳性表达为Donkel荧光素标记的绿光。

1.9 Western blot法检测小鼠卵巢ER、c-Myc和TERT的表达

取一侧卵巢,进行组织蛋白提取后,采用BCA法测定蛋白浓度。再按照以下步骤进行:聚丙烯酰胺制胶、电泳、PVDF转膜、封闭,取出已封闭的PVDF膜,加入一抗,4 ℃孵育过夜，浸于1×TBST缓冲液中,于摇床上洗涤3次,每次8 min，加入二抗,于室温摇床上孵育1.5 h,洗膜、ECL化学发光显影。以GAPDH为内参进行统计分析。

1.10 统计学分析

2 结果

2.1 补肾健脾方对小鼠动情周期的影响

正常组以动情前期、动情期、动情后期和动情间期的动情周期规律呈现循环。模型组造模后呈现动情周期规律的紊乱,基本处于动情后期和动情间期阶段。补肾健脾方组小鼠在给药2周后出现动情前期和动情期延长,阳性药组小鼠在给药后一直处于动情期。动情周期的变化见图1。

注:动情前期大部分是有核上皮细胞,少量角化细胞,无白细胞;动情期基本是角化细胞,偶有少量上皮细胞;动情后期是有核上皮细胞、角化细胞、白细胞同时存在;动情间期大部分是白细胞,少量上皮细胞和黏液。图1 小鼠动情周期细胞变化图

2.2 补肾健脾方对小鼠血清E2、FSH水平的影响

与正常组相比,模型组E2水平显著降低(P<0.05),FSH水平明显升高(P<0.01)。补肾健脾方组E2水平明显高于模型组(P<0.05),FSH水平明显低于模型组(P<0.05,P<0.01)。结果见表1。

表1 补肾健脾方对小鼠血清E2、FSH水平的影响

注:与正常组比较,△P<0.05,△△P<0.01;与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01。

2.3 补肾健脾方对小鼠卵巢病理组织学的影响

正常组小鼠卵巢皮质区未见异常,显示卵泡的各个阶段包括初级卵泡、次级卵泡、成熟卵泡和黄体。与正常组相比,模型组皮质区可见卵泡各期分布,但初次级卵泡率、成熟卵泡率和黄体数目下降(P<0.05),闭锁卵泡率高于正常组(P<0.01)。补肾健脾方高剂量组小鼠卵巢中的初次级卵泡率和成熟卵泡率多于模型组(P<0.05),闭锁卵泡和黄体减少(P<0.05),结果见图2，表2。

图2 补肾健脾方对小鼠卵巢病理组织学的影响(HE)

表2 各组小鼠卵巢组织形态学比较

注：与正常组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。

2.4 补肾健脾方对小鼠卵巢透明带的影响

正常组卵巢未见透明带呈现很亮的绿光圈,模型组卵巢可见明显的透明带绿色荧光。补肾健脾方组透明带绿光圈荧光与模型组相比荧光不明显,颜色不呈现亮色荧光绿。结果见图3。

注:箭头表示卵巢透明带光圈。图3 补肾健脾方对小鼠卵巢透明带的影响(×200)

2.5 补肾健脾方对小鼠卵巢ER、c-Myc和TERT表达的影响

与正常组相比,模型组ER、c-Myc和TERT蛋白的表达显著降低(P<0.01)。补肾健脾方组ER、c-Myc和TERT的表达明显高于模型组(P<0.05,P<0.01)。结果见图4,表3。

图4 补肾健脾方对小鼠卵巢ER、c-Myc和TERT表达的影响

3 讨论

近期有研究报道,雌激素与ER相结合可以促进转录因子c-Myc的表达[22-23]。c-Myc是一种转录蛋白,通过抑制或促进靶基因的转录而发挥作用。TERT是c-Myc下游靶蛋白,受c-Myc的转录调控[24-25]。c-Myc参与TERT基因的转录调节并且在调控卵巢功能中发挥重要作用。ER/c-Myc/TERT信号通路异常与POF的发生密切相关,因此,从ER/c-Myc/TERT信号通路着手研究补肾健脾方对信号通路中相关因子的表达影响有利于其机制的全面阐明。中医药在调理POF方面有独特的优势,可以全面调理女性各脏器功能,使雌孕激素的分泌水平趋于均衡状态,增强全身免疫力。妇女卵巢功能衰退的根本所在是肝肾不足,补肾健脾方据此组方而成。方中有滋养肝肾的鳖甲、续断、何首乌,补益肝肾之阴的枸杞子,健脾的白术、茯苓,共奏滋补肝肾,健脾胃,调冲任之效。本研究中模型组动物动情周期紊乱,E2水平降低,FSH水平升高,卵巢透明带荧光明显,说明POF模型建立成功。同时,模型组ER、c-Myc、TERT蛋白表达低下,显示ER/c-Myc/TERT信号通路与POF具有相关性。补肾健脾方干预在提高POF动物E2水平的同时,降低了FSH的水平,同时促进卵巢卵泡的发育,提高卵巢ER、c-Myc、TERT蛋白的表达。

表3 各组小鼠卵巢ER、c-Myc和TERT相对表达量的比较

注:与正常组比较,△△P<0.01;与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01。

综上所述,雌激素调控的ER/c-Myc/TERT信号通路功能异常与POF密切相关,补肾健脾方能通过促进ER的激活,刺激c-Myc的表达,调节TERT蛋白的表达，从而促进卵巢颗粒细胞的增殖发育以及卵母细胞的成熟,可能是其发挥治疗POF作用的有效机制。

本研究从E2对端粒酶的催化亚单位TERT基因转录调控的途径出发,更全面地探讨补肾健脾方治疗POF作用机制,为以后研发治疗POF的药物和方法提供新的方向和靶点,具有十分重要的实际应用价值。今后将从细胞水平上进一步研究补肾健脾方对卵巢颗粒细胞E2分泌以及ER/c-Myc/TERT信号通路分子表达的影响。