白头翁汤对溃疡性结肠炎模型小鼠肠道菌群及短链脂肪酸的影响

胡静怡,朱磊,连紫宇,程成,冯皖,沈洪

(南京中医药大学附属医院,江苏 南京 210029)

溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)是一种终身性、进展性、致残性肠道疾病。在我国,UC发病率逐年增加,给患者带来了严重的经济负担,影响患者身心健康,降低生存质量。肠道菌群及短链脂肪酸(Short chain fatty acids,SCFAs)在维持肠道内环境稳态中起着重要作用,越来越多的研究发现,UC患者肠道菌群较健康人群明显异常,SCFAs尤其丁酸含量明显降低,导致肠上皮细胞免疫调节异常。靶向肠道菌群及SCFAs已成为UC治疗的方向。白头翁汤出自《伤寒论》,由白头翁、黄连、黄柏、秦皮组成,具有清热解毒,凉血止痢功效,被历代医家视为治痢经典名方,现今仍广泛用于治疗溃疡性结肠炎。本文拟通过葡聚糖硫酸钠(Dextran sulphate sodium,DSS)诱导UC模型小鼠,给予白头翁汤干预以探讨其治疗UC的作用机制。

1 材料

1.1 实验动物

选取C57BL/6J雄性小鼠38只,6～8周,购自浙江维通利华实验动物技术有限公司，许可证号:SCXK(浙)2020-0002。饲养条件:12 h光照/黑暗循环,温度(20±2)℃,湿度(50±10)%,适应性饲养1周。

1.2 药物

白头翁汤由白头翁、黄柏、黄连、秦皮按15∶12∶6∶12比例组成,中药饮片购于南京中医药大学附属医院。饮片按比例称量,以10倍超纯水浸泡30 min,100 ℃煎煮40 min,收集药液,10倍超纯水2次煎煮40 min,收集药液。合并2次药液,收集上清液,旋转蒸发至所需浓度。白头翁汤低剂量组给药量为6.75 g·kg-1,白头翁汤高剂量组给药量为20.25 g·kg-1。5-氨基水杨酸(5-ASA)(货号：A3537)购于Sigma公司,给药剂量为50 mg·kg-1,DSS(货号：216011080)购于MP Biomedicals公司,分子量36 000～50 000 Da,将其溶于超纯水中,制备成2.5%的溶液。

1.3 试剂和仪器

Trizol试剂盒(货号：10296010)购自美国Invitrogen公司,逆转录试剂盒(货号：R232-01)购自诺唯赞公司,E.Z.N.A. Stool DNA Kit(货号：D4015-01)购自Omega Bio-tek公司,TransStart FastPfu DNA Polymerase(货号：AP221-01)购于北京全式生物技术有限公司,AxyPrep DNA GelExtraction Kit(货号：AP-GX-50G)购于Axygen BioScience公司。奥林巴斯CKX41倒置显微镜,罗氏PCR仪480,安捷伦7890B/5977A GC/MSD气质联用仪。

2 方法

2.1 实验分组

将38只小鼠随机分为5组,正常组(Ctrl)6只,模型组(DSS)8只,白头翁汤低剂量组(DSS+BTW-L)8只,白头翁汤高剂量组(DSS+BTW-H)8只,5-ASA(DSS+5-ASA)8只。

2.2 UC小鼠模型构建

将DSS溶于饮用水中，配置成2.5%DSS溶液，小鼠自由饮用7 d(每2～3 d更换溶液)以构建UC模型，第8天起将饮用水更换为超纯水；正常组小鼠实验过程中给予超纯水。实验第1～10天,不同剂量白头翁汤组给予相应浓度白头翁汤灌胃,5-ASA组给予5-ASA溶液灌胃,正常组和模型组给予蒸馏水灌胃,实验过程中记录小鼠体质量变化、腹泻、便血情况。第11天终止实验,眼眶静脉丛采血,4 000 r·min-1离心10 min,收集血清;分离小鼠结肠,测量长度;收集结肠末端1 cm,置于福尔马林液里固定，剩余结肠组织放入1.5 mL EP管中，-80 ℃保存;收集回盲瓣内容物,放入无菌的1.5 mL EP管中。

2.3 结肠组织病理学观察

取固定的组织,依次进行脱水、透明、石蜡包埋、切片、脱蜡、苏木精-伊红染色,光学显微镜下观察结肠组织损伤情况。

2.4 qPCR法检测小鼠结肠组织中炎症因子表达

称取10 mg结肠组织，采用Trizol法提取总RNA，采用NanoDrop 2000测定总RNA的浓度和纯度，确保1.8<吸光度比值(A260 nm/A280 nm)<2.0。参照逆转录试剂盒说明书进行逆转录，合成cDNA，用cDNA模板对甘油磷酸-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)及IL-1β、IL-6、TNF-α及IL-10基因分别进行扩增，引物由英维捷基设计合成，具体序列如下:GAPDH上游5'-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3'，下游5'-GGGGTCGTTGATGGCAACA-3'；IL-1β上游5'-CTTTCCCGTGGACCTTCCAG-3'，下游5'-AATGGGAACGTCACACACCA-3'；IL-6上游5'-CCACTTCACAAGTCGGAGGCTTA-3',下游5'-AGTGCATCATCGTTGTTCATAC-3';IL-10上游5'-CTTACTGACTGGCATGAGGATCA-3',下游5'-GCAGCTCTAGGAGCATGTGG-3';TNF-α上游5'-CTCATGCACCACCATCAAGG-3',下游5'-ACCTGACCACTCTCCCTTTG-3'。

2.5 小鼠粪便微生物DNA提取、PCR反应、测序文库构建、测序和数据分析

根据试剂盒说明书操作步骤，使用E.Z.N.A. Stool DNA Kit提取小鼠回盲瓣内容物中的微生物DNA。DNA质量监测合格后，对DNA样本进行16S核糖体RNA基因V3～V4(341F-806R)区域的PCR进行扩增。引物341F:5'-CCTAYGGRBGCACAG-3',806R：5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3'。PCR反应体系包含4 μL 5×FastPfu Buffer、2 μL 2.5 mmol·L1dNTPs、0.8 μL下游引物、0.4 μL FastPfu DNA Polymerase和10 ng模板DNA。qPCR反应程序如下：95 ℃初始变性5 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，27个循环；72 ℃ 10 min，10 ℃无限循环。扩增产物使用AxyPrep DNA Gel extraction kit纯化。产物进行Illumina NovaSeq PE250文库构建及测序。以上工作委托上海欧易生物科技有限公司完成。Illumina NovaSeq PE250测序获得的序列，对Reads的质量进行质控过滤，对质控拼接好的序列按照97%相似性进行OTU聚类分析。基于OTU聚类分析结果进行多样性指数分析、测序深度的检测，基于分类学信息在各个分类水平上进行群落结构的统计分析。

2.6 GC-MS检测小鼠肠道SCFAs含量

将冻干的回盲瓣内容物研磨成粉,称取10 mg,加入700 μL提取液(乙腈∶超纯水=7∶3),震荡后离心,取上清至新的1.5 mL EP管中,真空干燥。向干燥后的试管中加入衍生化试剂,超声后加入乙腈,离心后取上清待检测。Agilent 7890A气相色谱-安捷伦5977惰性色谱系统XL EI/CI质谱检测器。电子能量设定为-70 V,全扫描模式(m/z30～600)收集质谱数据,分析样本中甲酸、乙酸、丙酸、丁酸和戊酸含量。

2.7 统计学方法

实验数据采用Graphpad prism8软件One-WayANOVA方法进行分析。小鼠肠道菌群丰度比较采用Wilcoxon秩和检验分析,P<0.05为差异有统计学意义。PCoA统计分析采用R语言完成。

3 结果

3.1 白头翁汤对UC小鼠一般情况影响

在实验1～5 d内小鼠体质量无明显变化,第6天模型组小鼠体质量明显下降,出现明显的血便,而给予不同剂量白头翁汤干预可减轻小鼠体质量下降症状,与模型组相比具有统计学差异;给予5-ASA干预虽能改善小鼠体质量下降症状,但无统计学差异(图1A)。疾病活动指数(DAI)由体质量、腹泻和便血评分组成[1],结果如图1B所示,1～4 d内，各组小鼠一般状况良好，第5天模型组小鼠出现稀水样便，6～7 d DAI明显升高，8～10 d无明显改变；给予不同剂量白头翁汤和5-ASA可降低DAI，其中白头翁高剂量组与模型组存在统计学差异(P<0.05)。模型组小鼠结肠长度较正常小鼠明显缩短(P<0.01),给予白头翁汤不同剂量干预后小鼠结肠长度明显增加(P<0.05,P<0.01),而5-ASA组小鼠结肠长度虽有增加,但无统计学差异(图1C)。

注:Ctrl.正常组;DSS.模型组;DSS+BTW-L.白头翁汤低剂量组;DSS+BTW-H.白头翁汤高剂量组;DSS+5-ASA.5-ASA组。与Ctrl组相比,#P<0.05,##P<0.01；与DSS组相比,*P<0.05,**P<0.01。图1 白头翁汤对DSS诱导模型小鼠体质量、DAI及结肠长度的影响

3.2 白头翁汤对UC小鼠结肠病理影响

如图2所示,正常组小鼠结肠组织结构完整,无明显炎症细胞浸润。模型组小鼠结肠组织结构紊乱,个别样本结肠形态完全消失;给予白头翁汤和5-ASA干预后,可维持小鼠结肠组织形态,降低炎性细胞浸润,组织学评分较模型组显著下降(P<0.01)。

3.3 白头翁汤对UC小鼠结肠炎症因子表达影响

与正常组小鼠相比,模型组小鼠结肠组织中促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA水平显著增加(P<0.05，P<0.01),抑炎因子IL-10虽降低,但无统计学差异;给予白头翁汤干预后,IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA表达水平明显降低(P<0.05,P<0.01);给予5-ASA干预后IL-6 mRNA水平明显降低(P<0.05)，IL-1β和TNF-α mRNA表达呈下降趋势,但无统计学差异(如图3)。

注:与Ctrl组相比,##P<0.01；与DSS组相比,图2 白头翁汤对DSS诱导肠炎小鼠结肠病理的影响

注:与Ctrl组相比,#P<0.05，##P<0.01；与DSS组相比,图3 白头翁汤对DSS诱导肠炎小鼠结肠组织炎症因子表达的影响

3.4 白头翁汤对UC小鼠肠道菌群的影响

通过16S rRNA方法对小鼠回盲瓣微生物组成进行测定,结果如图4A所示,通过PCoA分析发现正常组、模型组、白头翁汤高剂量组和低剂量组分布于不同区域,说明各组肠道菌群结构存在差异,但高剂量白头翁汤干预后小鼠肠道菌群更趋向于正常小鼠肠道菌群。对各组肠道菌群β多样性进行分析发现,各组Chao指数无统计学差异,Shannon指数结果表明模型组较正常组明显降低(P<0.01),给予白头翁汤不同剂量干预后,Shannon指数明显增加(P<0.05,P<0.01),说明白头翁汤可部分肠道菌群多样性,维持肠道菌群结构稳态(图4B～C)。

3.5 白头翁汤对产SCFAs菌影响

进一步对菌群组成进行分析发现,在门水平上,模型组小鼠厚壁菌门(Firmicutes)相对丰度较正常组明显降低(P<0.05),而拟杆菌门(Bacteroides)相对丰度较正常组明显增加(P<0.01),Firmicutes相对丰度与Bacteroides相对丰度比值(F/B)降低(P<0.01)。给予白头翁汤干预后,白头翁汤组小鼠Bacteroides相对丰度明显降低(P<0.05,P<0.01),Firmicutes相对丰度虽增加,但无统计学差异,白头翁汤高剂量组F/B较模型组明显升高(P<0.05)。在属水平上,模型组小鼠中Coprococcus和Roseburia菌相对丰度明显降低(P<0.05,P<0.01),给予高剂量白头翁汤干预后可明显增加这些菌群相对丰度(P<0.05,P<0.01)。见图5。

注:与Ctrl组相比,#P<0.05,##P<0.01；与DSS组相比,图5 白头翁汤对产SCFAs菌影响

3.6 白头翁汤对UC小鼠回盲瓣SCFAs含量的影响

运用GC-MS方法对小鼠回盲瓣SCFAs含量进行测定,结果如图6所示。与正常组相比,模型组小鼠回盲瓣中丁酸和戊酸含量明显降低(P<0.01),甲酸、丙酸含量无明显变化,乙酸含量增加,但无统计学差异;给予白头翁汤干预后可显著增加回盲瓣内容物中丁酸和戊酸含量(P<0.01),乙酸含量虽降低,但无统计学差异。各组中甲酸含量无明显变化。

注:FA.甲酸；AA.乙酸；PA.丙酸；BUA.丁酸；VA.戊酸。与Ctrl组相比,##P<0.01；与DSS组相比,图6 白头翁汤对UC小鼠回盲瓣SCFAs含量影响

4 讨论

肠道菌群及其代谢物在维持肠道内环境稳态中具有重要作用。SCFAs是由肠道微生物发酵膳食纤维生成的碳原子数<6的有机脂肪酸,主要包括乙酸、丙酸和丁酸。乙酸主要由Akkermansiamuciniphila,Bacteroidesspp.,Bifidobacteriumspp.,Prevotellaspp.,Ruminococcusspp.,Clostridiumspp.和Streptococcusspp.[2]通过乙酰辅酶A或Wood-Ljungdahl途径代谢丙酮酸产生;丙酸在Bacteroidesspp.,Phascolarctobacteriumsuccinatutens,Dialisterspp.,Veillonellaspp.,Megasphaeraelsdenii,Coprococcuscatus,Salmonellaspp.,Roseburiainulinivorans和Ruminococcusobeum[3]作用下通过琥珀酸途径或丙烯酸酯途径代谢磷酸烯醇式丙酮酸产生;丁酸在Coprococcuscomes,Coprococcuseutactus,Anaerostipesspp.,Coprococcuscatus,Eubacteriumrectale,Eubacteriumhallii,Faecalibacteriumprausnitzii和Roseburiaspp.作用下通过磷酸转丁酰酶/丁酸激酶途径或丁酰辅酶A/乙酸辅酶A转移酶途径生成[4]。SCFAs参与肠道多种细胞的调节,在肠道免疫中发挥着重要作用。研究表明,SCFAs可通过游离脂肪酸受体2(GPR43)和组蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylase,HDAC)诱导结肠Treg细胞分化,增强肠道屏障功能[5]。丁酸盐是结肠上皮细胞的主要能量来源,还能通过激活炎症小体产生IL-18促进上皮稳态[6]。

肠道菌群与宿主免疫系统相互影响,二者之间处于动态平衡,当这一平衡被打破可诱发炎症免疫反应导致炎症性肠病(IBD)的发生。越来越多研究显示IBD患者粪便菌群中产SCFAs细菌如Faecalibacteriumprausnitzii和Roseburiahominis相对丰度较健康人群降低[7],粪便中SCFAs含量降低[8],参与丁酸代谢的丁酰辅酶A、乙酸辅酶A基因表达量下降[9-10]。研究发现Alistipes和Roseburia与SCFAs呈正相关[11],在化学和病原体诱导的肠炎模型下二者均呈下降趋势。通过外源性补充丁酸可激活结肠上皮细胞和免疫细胞中的G蛋白偶联受体109A(GPR109A),抑制HDAC,进而降低结肠巨噬细胞及树突状细胞中促炎因子的分泌，导致结肠巨噬细胞和树突状细胞促炎细胞因子表达减少[12],从而起到治疗作用。

白头翁汤是治疗久痢的经典名方,既往研究发现白头翁汤可通过抑制IL-6/STAT3信号通路调节肠道炎症反应[13]、恢复Th17/Treg平衡维持肠道屏障[14]、恢复胆汁酸代谢[15]等起到治疗UC小鼠的作用。本研究发现白头翁汤可恢复UC小鼠肠道菌群结构,使其趋向于健康小鼠肠道菌群,增加产SCFAs菌Alistipes、Coprococcus和Roseburia相对丰度,恢复肠道中丁酸和戊酸含量。

综上所述,白头翁汤可通过调节肠道菌群恢复SCFAs含量,维持肠道内环境稳态，发挥治疗UC作用,但其具体免疫机制有待进一步研究。